蛋白定量的方法有很多種，應(yīng)用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測(cè)法和Bradford蛋白定量檢測(cè)法，市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測(cè)方法而開(kāi)發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白與定量試劑經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的反應(yīng)（BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min，Bradford法反應(yīng)一般為37℃，5min），酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值，繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算WB蛋白的濃度。

蛋白定量:

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測(cè)蛋白濃度，蛋白濃度測(cè)定方法如下：

A.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液

取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長(zhǎng)期保存。

B.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準(zhǔn)確。

C.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）

將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

D.準(zhǔn)備待測(cè)樣品

將待測(cè)的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，確保檢測(cè)結(jié)果可信），按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測(cè)樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

E.配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個(gè)待測(cè)樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費(fèi)。

F.檢測(cè)

向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測(cè)樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比，在562 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)） 

G.計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測(cè)樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測(cè)樣品實(shí)際蛋白濃度。

提示：

1. BCA法測(cè)定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大，吸光度值會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，建議每次測(cè)定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時(shí)，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測(cè)條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測(cè)定。

4. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性手套。