一、試劑盒的組成與工作原理

試劑盒的組成

活/死細胞雙染色試劑盒主要包含兩種關鍵熒光染料：用于標記活細胞的綠色熒光染料和用于標記死細胞的紅色熒光染料。這兩種染料具有不同的化學特性和作用機制，能夠分別與活細胞和死細胞中的特定成分結合，從而實現對細胞生死狀態的區分。

工作原理

綠色熒光染料（如 Calcein-AM）能夠自由穿透活細胞的細胞膜，并在細胞內被酯酶轉化為具有熒光的 Calcein，從而發出明亮的綠色熒光。這一特性使得綠色熒光染料成為標記活細胞的理想選擇。活細胞的膜完整性良好，能夠有效地攝取并保留綠色熒光染料，而死細胞由于細胞膜的破損，無法有效攝取或保留該染料。

紅色熒光染料（如 PI）則主要用于標記死細胞。PI 是一種核酸染料，能夠與細胞內的 DNA 結合并發出紅色熒光。在活細胞中，細胞膜的完整性阻止 PI 進入細胞內；而在死細胞中，細胞膜的破損使得 PI 能夠自由進入并與 DNA 結合，從而發出紅色熒光。

二、操作使用方法

染色前準備

1. 細胞培養：根據實驗需求，將細胞培養至適宜的密度。對于貼壁細胞，可使用胰蛋白酶消化并收集細胞；對于懸浮細胞，直接收集即可。用PBS 洗滌細胞兩次，去除培養基和其他雜質。

2. 細胞計數與調整濃度：對收集到的細胞進行計數，并用適當的緩沖液調整細胞濃度，一般建議的細胞濃度范圍為

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   ，以確保在后續的染色和檢測過程中能夠獲得理想的信號強度和細胞分布。

染色過程

1. 取適量細胞懸液：取適量的細胞懸液（通常為 100 μL），加入到新的離心管或培養皿中。

2. 加入染色試劑：按照試劑盒說明書的要求，分別加入適量的綠色熒光染料和紅色熒光染料。一般情況下，每 100 μL 細胞懸液中需加入數微升的每種染料，具體用量應根據試劑盒的推薦進行調整。

3. 輕輕混勻：輕輕吹打或漩渦混勻細胞懸液，確保染料均勻分布并充分接觸細胞。這一步驟對于保證染色的均勻性和準確性至關重要。

4. 避光孵育：將染色后的細胞懸液置于適當的溫度（如 37℃）下避光孵育一段時間，通常為 15 - 30 分鐘。避光孵育有助于防止染料的光漂白，確保熒光信號的穩定和清晰。

染色后處理

1. 去除未結合的染料：用預冷的 PBS 或其他適當的緩沖液洗滌細胞一次，以去除未結合的染料。離心速度為 300×g，離心時間為 5 分鐘。用適量的緩沖液重新懸浮細胞，以減少背景熒光并提高檢測的準確性。

2. 分析檢測：將染色后的細胞懸液轉移到流式細胞儀檢測管或熒光顯微鏡載玻片上，立即進行檢測。在流式細胞儀中，綠色熒光的激發波長一般為 488 - 500 nm，發射波長為 510 - 530 nm；紅色熒光的激發波長一般為 490 - 540 nm，發射波長為 600 - 630 nm。

三、質量控制與注意事項

質量控制

活/死細胞雙染色試劑盒應保存在 4℃左右的低溫環境中，避免光照直射和溫度波動過大。在保存過程中，注意密封保存，防止試劑揮發或吸收水分。試劑盒在有效期內具有良好的穩定性，每一批次都經過嚴格的質量檢測，確保其性能符合要求。

注意事項

在實驗過程中，需嚴格遵循無菌操作規范，避免細胞受到污染。使用的試劑、培養容器和操作工具都應經過嚴格的滅菌處理。實驗操作應在超凈工作臺中進行，以降低污染風險。

染色時間應根據細胞類型和實驗需求進行優化。過短的染色時間可能導致染色不充分，影響檢測結果；過長的染色時間則可能導致非特異性染色，增加背景信號。建議在正式實驗前進行小規模的預實驗，以確定最佳的染色條件。

這兩種熒光染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。在染色和檢測過程中，應使用適當的避光措施，如使用避光罩或在暗室中操作。細胞狀態監測：實驗全程觀察細胞狀態，確保良好生理狀態，異常時及時調整條件。