CRISPR-Cas9系統自發現以來，已迅速成為基因編輯領域的核心工具，廣泛應用于疾病模型構建、生物通路解析及遺傳疾病治療。然而，CRISPR-Cas9在體內的有效遞送仍是其臨床應用的主要障礙。病毒載體因其高效性和組織特異性被廣泛使用，但其免疫原性和基因組整合風險限制了其臨床應用。非病毒載體如脂質納米顆粒（LNP）因低毒性和可控的遞送效率而備受關注，但傳統LNP主要分布于肝臟，對肺等非肝臟組織的遞送效率較低。本研究旨在開發一種能夠高效遞送CRISPR-Cas9 RNP至肺部的LNP制劑。
材料與方法
采用微流體混合技術，將可電離脂質、DOTAP、中性輔助脂質DOPE、膽固醇及PEG化脂質按特定比例混合于乙醇相，同時將Cas9蛋白與sgRNA按1:1摩爾比混合于PBS緩沖液中形成RNP復合物，兩相混合后形成LNP。通過動態光散射（DLS）和ζ電位分析表征LNP的粒徑、多分散性指數（PDI）及表面電荷。合成一系列可電離脂質庫，通過微流體混合技術形成LNP庫，并封裝針對EGFP的RNP。利用流式細胞術評估各LNP在H1299細胞中的基因敲除效率，篩選出高效LNP。進一步采用設計實驗（DOE）方法，優化LNP的脂質組成，評估其對RNP及單鏈DNA（ssDNA）的封裝和遞送效率。采用高通量DNA條形碼技術，將特異性DNA條形碼引入各LNP制劑中，混合后靜脈注射至小鼠體內。6小時后收集心、肺、脾、腎、肝及淋巴結等器官，通過下一代測序（NGS）分析各器官中DNA條形碼的分布，評估LNP的體內生物分布特性。
選擇高效且具有肺部趨向性的LNP制劑（A14），封裝針對loxP位點的雙sgRNA，靜脈注射至Ai14/Ai6交叉小鼠體內。通過流式細胞術和免疫組化分析肺內皮細胞、上皮細胞及免疫細胞的基因編輯效率。同時，評估該LNP制劑在編輯臨床相關基因靶點（如TTR）中的效果。
實驗結果
2.1 LNP制劑的篩選與優化結果：
初始離子化脂質篩選：通過高通量篩選技術，我們對24種不同的離子化脂質進行了評估，這些脂質被用于構建封裝CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的脂質納米顆粒（LNP）。篩選過程中，我們利用流式細胞術測量了H1299細胞中增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的敲除效率，作為評估LNP基因編輯效能的指標。結果顯示，四種離子化脂質（C12-5、C14-2、C14-5、C14-7）表現出高效的基因敲除能力，其效果與商業化的CRISPRmax對照相當，甚至在某些劑量下表現更優（圖1C, D）。
Figure 1. Identification of top ionizable lipids for in vitro gene knockout.
設計實驗（DOE）優化LNP脂質組成：為了進一步優化LNP的脂質組成，我們采用了設計實驗（DOE）方法，構建了一個包含7776種可能LNP配方的設計空間，但僅通過測試25種代表性LNP來評估。這25種LNP封裝了針對EGFP的RNP和單鏈DNA（ssDNA），用于評估基因敲除（通過非同源末端連接，NHEJ）和敲入（通過同源定向修復，HDR）效率。結果顯示，六種LNP配方（A3, A4, A5, A14, A21, A22）在H1299細胞中表現出高效的基因編輯能力，與基礎配方相當。進一步的多重線性回歸分析表明，離子化脂質類型對基因編輯效率的影響最為顯著，其次是蛋白-脂質重量比和DOPE含量（圖3）。
Figure 2. Optimizing LNP excipient components for RNP and ssDNA delivery and resulting knock-in editing using a design of experiment (DOE) approach. (A) DOE allows for a design space of 7776 LNPs to be analyzed by testing only 25 LNPs.
Figure 3. Identifying LNP components that significantly influence knockout and knock-in efficiencies.2.2 體內生物分布評估結果：
高通量DNA條形碼技術：為了評估LNP在體內的生物分布特性，我們采用了一種高通量DNA條形碼技術。每種LNP制劑中引入了特異性DNA條形碼，混合后靜脈注射至小鼠體內。6小時后，收集心、肺、脾、腎、肝及淋巴結等器官，通過下一代測序（NGS）分析各器官中DNA條形碼的分布。結果顯示，不同LNP制劑在體內的生物分布存在顯著差異，但基于DOTAP的肺部趨向性機制在高通量篩選中未得到準確反映（圖4）。Figure 4. High-throughput evaluation of in vivo organ accumulation using DNA barcoding.對照篩選：為了驗證高通量篩選的結果，我們選擇了四種LNP制劑（基礎LNP、A9、A14、A24）進行個體對照篩選。這些LNP被標記上DiR熒光染料，并單獨靜脈注射至小鼠體內。通過體內成像系統（IVIS）觀察LNP在肺部的積累情況。結果顯示，A9、A14和A24在肺部的積累量顯著高于基礎LNP，尤其是A9表現出最高的肺部積累（圖4F）。然而，高通量篩選中未準確預測到A9的高肺部趨向性，這可能與凝血機制及LNP劑量有關。Figure 5. Four LNP formulations identified the base LNP, A9, A14, and A24 show dose-responsive editing in vitro and limited toxicity only at the highest dose tested.
2.3 體內基因編輯評估結果：
Ai14/Ai6交叉小鼠模型中的基因編輯：為了評估LNP在體內的基因編輯效率，我們選擇了高效且具有肺部趨向性的A14 LNP制劑，封裝了針對loxP位點的雙sgRNA，并靜脈注射至Ai14/Ai6交叉小鼠體內。通過流式細胞術分析，我們發現A14 LNP在肺內皮細胞、上皮細胞及免疫細胞中均實現了高效的基因編輯，編輯效率隨劑量增加而提高（圖6C, D）。特別是在單次注射后，A14 LNP在肺單核細胞中的編輯效率達到近8%，在內皮細胞和上皮細胞中分別達到16%和6%。TTR基因編輯模型中的特異性：為了評估A14 LNP在編輯臨床相關基因靶點中的特異性，我們構建了TTR基因編輯模型。A14 LNP封裝了針對TTR的sgRNA，并靜脈注射至小鼠體內。結果顯示，A14 LNP僅在肺部實現了高效的TTR基因編輯，未觀察到肝臟脫靶效應（圖6F）。相比之下，基礎LNP在肺部和肝臟均實現了基因編輯，導致血清中前白蛋白水平顯著降低。這一結果表明，A14 LNP制劑具有高度的特異性，能夠有效避免肝臟脫靶效應。Figure 6. Base, A14, and A24 LNP formulations show variable biodistributions and gene editing in vivo. 討論
本研究成功開發了一種具有肺部趨向性的LNP制劑（A14），該制劑能夠高效遞送CRISPR-Cas9 RNP至肺內皮和上皮細胞，實現針對模型報告基因及臨床相關基因靶點的基因編輯，且在肝臟中未觀察到脫靶效應。這一發現為CRISPR-Cas9技術在肺部疾病治療中的應用提供了新的遞送策略，具有廣闊的臨床應用前景。
參考文獻：Haley, Rebecca M., et al. "Lipid Nanoparticles for In Vivo Lung Delivery of CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins Allow Gene Editing of Clinical Targets." ACS nano (2025).
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