一、背景

HCT-15細胞專用培養基可保持HCT-15細胞的生長狀態。培養基中已包含HCT-15細胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于HCT-15細胞的體外培養。

二、細胞培養操作

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為類；

1、細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應用

用于水蠟樹果實提取物對結腸癌HCT-15細胞的增殖、千移及凋亡誘導因子AIF表達的影響研究：

通過體外實驗研究水蠟樹果實提取物（Fruit of Ligustrum Obtusifolium Extract,FLOE）對結腸癌HCT-15細胞的增殖、遷移及凋亡誘導因子（Apoptosisi Iducing Fctor,AIF）表達的影響,探討其可能的作用機制,為中藥在結腸癌治療中的研發及AIF應用于結腸癌治療提供更多的理論依據。

方法：體外培養結腸癌細胞株HCT-15,取對數期細胞用于實驗。將FLOE用不培養基RPMI-1640稀釋成不同濃度:0μg/ml（對照組）、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組,并用RPMI-1640不培養基稀釋75%酒精（20μg/ml）,設置陰性對照。

采用普通光學顯微鏡觀察在不同濃度藥物分別處理24h、48h、72h、96h后細胞形態學變化,并在顯微鏡下計算貼壁細胞數量。采用MTS法檢測不同濃度藥物分別處理24h、48h、72h、96h后,對HCT-15細胞存活率的影響。采用集落實驗檢測不同濃度FLOE對結腸癌HCT-15細胞生存能力的影響;劃痕實驗檢測在不同濃度藥物處理后,對HCT-15細胞遷移能力的影響。

采用Western bolt法檢測在不同濃度藥物作用48h后,對HC15細胞凋亡相關蛋白及AIF表達的影響。結果:隨著FLOE藥物濃度的增高及作用時間的延長,HCT-15細胞伸展變差、細胞間隙增大、空泡化、細胞漂浮,細胞計數發現貼壁細胞也隨之減少。MTS結果表明與對照組相比FLOE處理后的細胞存活率降低（P<0.05）,且呈時間及濃度依賴性。

劃痕實驗結果表明與對照組相比FLOE處理后的細胞劃痕區域相對寬度較寬（P<0.05）。集落實驗結果表明FLOE處理后細胞集落形成數量明顯降低,與對照組相比集落抑制率有統計學意義（P<0.05）。Western bolt實驗結果表明隨著FLOE濃度的增高,Survivin、Mcl-1蛋白表達水平明顯降低,而凋亡誘導因子AIF表達增加。

結論：水蠟樹果實提取物能抑制HCT-15細胞增殖及遷移,且呈濃度及時間依賴性。其機制可能通過下調抗凋亡蛋白的表達及上調凋亡誘導因子AIF的表達實現。

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