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可電離脂質用于脂質納米顆粒介導的DNA遞送的比較研究

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司 2025年02月13日 16:02

“基因治療作為一種新興的治療方法，在遺傳性疾病、癌癥等領域展現出巨大潛力。LNPs作為非病毒基因載體，具有安全性高、制備簡便等優點，被廣泛用于核酸遞送。LNPs的設計關鍵在于可電離脂質的選擇，其理化性質直接影響LNP的穩定性和轉染效率。本研究旨在比較不同臨床用可電離脂質在LNP介導的DNA遞送中的性能，為優化LNP基因載體提供實驗依據。”

圖一、DNA/LNP的設計和實驗驗證模型

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實驗材料

可電離脂質：DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102、ALC-0315。
輔助脂質：膽固醇、DOPC（二油酰磷脂酰膽堿）、DMPE-PEG2k（1,2-二甲基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）。
DNA質粒：編碼熒光標記物或熒光素酶的DNA表達質粒（3-4kbp）。
細胞系：快速增殖的人肝癌HuH-7細胞和緩慢復制的mPH細胞。
實驗動物：野生型小鼠。

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結果

2.1 LNP理化性質表征：

本研究中，針對RNA遞送設計的LNP脂質組成被評估其用于結合DNA表達質粒的潛力。所生成的DNA-LNP的脂質組成包括：1) 可電離脂質，2) 膽固醇，3) 輔助脂質，和4) PEG偶聯脂質，摩爾比為50:39:10:1（圖1A）。比較了三種臨床上使用的可電離脂質，即DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102和ALC-0315。

通過微流控混合技術封裝納米質粒DNA后，對DNA-LNP進行了表征。所有DNA-LNP制劑均在N/P比為6（即可電離脂質與DNA的電荷比）的條件下生成。表征結果顯示，所有制劑均呈現出適宜的粒徑和ζ電位，確保了它們的穩定性和細胞內攝取潛力。

圖二、DNA/LNP的表征

2.2 細胞轉染效率與基因表達：

為了評估LNP封裝的DNA的細胞攝取，使用Cy3標記了編碼EGFP的納米質粒DNA，并將其與HuH-7和mPH細胞孵育。DNA-LNP以10至50ng DNA/cm2的最終濃度添加，并孵育至72小時。通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡分析細胞攝取和轉基因表達。

在HuH-7細胞中，MC3 LNPs顯示出最高的EGFP表達水平，約60%的細胞表達了EGFP，而ALC-0315 LNPs的表達水平略低（40%）。在mPH細胞中，由于強自發熒光，選擇了tdTomato作為報告基因進行成像。SM-102 LNPs在此細胞系中表現出優勢，有7%的細胞表達了tdTomato，而ALC-0315 LNPs的表達水平顯著降低。

通過實時聚合酶鏈反應（qPCR）量化了DNA拷貝數的遞送。DNA-LNP孵育24小時后，使用QIAprep Spin Mini-prep Kit提取遞送的DNA，并制備DNA校準曲線以計算拷貝數。結果顯示，在HuH-7細胞中，MC3 LNPs遞送的DNA拷貝數最高，而在mPH細胞中，SM-102 LNPs顯示出最高的遞送效率。

圖三、DNA/LNP的體外攝取評價

圖四、DNA/LNP的體外轉染評價

2.3 生物分布分析：

通過尾靜脈注射向野生型小鼠體內遞送了封裝有20µg DNA的DNA-LNPs，并在24小時后處死小鼠以評估生物分布和轉基因表達。器官被收集、勻漿，并通過qPCR確定遞送的DNA拷貝數。結果顯示，肝臟和肺臟中積累了最高比例的熒光素酶DNA，分別為11.3±2.8%和7.5±1.9%的注射劑量（ID），而脾臟中的積累水平較低（2.6±0.7% ID）。這一趨勢在所有DNA-LNP制劑中均一致觀察到。

體內轉基因表達通過生物發光成像進行評估。在注射DNA-LNPs 24小時后，向小鼠腹腔注射d-熒光素，并使用生物成像系統監測生物發光。結果顯示，MC3和SM-102 LNPs在肝臟中誘導了顯著的熒光素酶表達，而ALC-0315 LNPs的表達水平較低。這些結果與體外實驗結果一致，進一步證實了MC3和SM-102 LNPs在DNA遞送和轉基因表達方面的優勢。

圖五、DNA/LNP在小鼠中的體內分布和表達

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討論

本研究表明，臨床用LNP制劑在設計用于DNA基因遞送時，需進行先期評估。可電離脂質的選擇對LNP的理化性質、細胞轉染效率和基因表達水平具有重要影響。含有ALC-0315的LNP在體內實驗中表現出更高的轉基因表達水平，這可能與其有利的理化性質、良好的細胞攝取和基因遞送能力有關。然而，SM-102在某些細胞系中表現出更高的DNA遞送量和熒光強度，提示在不同細胞環境中可能需要選擇不同的可電離脂質以優化基因遞送效果。

此外，LNP的粒徑、電荷等理化性質對細胞攝取和基因遞送具有重要影響。本研究中，含有ALC-0315的LNP粒徑小于100nm，有利于細胞攝取和基因遞送。未來研究可進一步探索LNP理化性質與基因遞送效率之間的關系，以優化LNP設計。

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結論

本研究通過比較不同臨床用可電離脂質在LNP介導的DNA遞送中的性能，發現含有ALC-0315的LNP在體內實驗中表現出更高的轉基因表達水平。這一發現為LNP在DNA基因治療中的應用提供了有價值的見解，為未來優化LNP基因載體提供了實驗依據。未來研究可進一步探索LNP理化性質、細胞攝取、基因遞送效率之間的復雜關系，以推動LNP在基因治療領域的廣泛應用。

參考文獻：Lotter, Claudia, et al. "Comparison of ionizable lipids for lipid nanoparticle mediated DNA delivery." European Journal of Pharmaceutical Sciences 203 (2024): 106898.

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