Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx

Subject terms: Homeostasis, Pathogenesis

機械應力可以有效地調節細胞活動，包括細胞增殖、凋亡、分化和自噬。鈣離子（Ca2+）通過機械敏感的 Piezo1 通道對機械刺激做出反應。Piezo1可以檢測機械應力，如靜壓、剪切應力和膜拉伸。此外，Piezo1 也是一種機械轉導介質，用于 Ca2+ 介導的髓核細胞（NPCs）中硬化細胞外基質（ECM）的激活。

椎間盤（IVD）是一個生理負壓器官。除了維持人體髓核（NP）組織的生理功能外，適當的機械應力在內部微環境中也起著重要作用。力學性能的變化與 IVD 結構和組成的異常變化之間存在正相關。此外，Piezo1 在退化的 NP 樣本中上調，機械應力激活的 Piezo1 可以通過骨膜素（periostin）和 NF-kB 的自我放大循環加速人類 NPCs 的衰老和椎間盤退變的進展。

鐵（Fe）是人體必需的元素。然而，病理性鐵積累可導致氧化性細胞損傷和鐵死亡，這是一種鐵依賴性的脂質過氧化、活性氧大量累積所致的細胞死亡模式。鐵死亡需要鐵，Piezo1 通道是機械敏感的離子通道。但是迄今為止，可用于鐵內流的分子很少。

鑒于此，山東大學齊魯醫院骨科、中南大學湘雅醫學院及天津醫院脊柱外科的聯合團隊在一項研究中旨在闡明 Piezo1 通道在 IVD 和 NPCs 鐵死亡中的作用，結果表明，Piezo1 是鐵代謝的關鍵調節因子，直接促進鐵內流、調節鐵代謝相關生物標志物和影響 GPX4 的表達（鐵死亡中的主要成分）。研究成果發表在 Bone Research  期刊題為“Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx”。

首先，為了研究機械應力誘導的 NPCs 變化，將原代大鼠 NPCs 分離并在無 Ca2+ 的培養基中施加1 MPa 的機械壓縮力。結果顯示，Piezo1 在機械應力下上調。此外，Piezo1 表達與鐵代謝基因（包括 ACSL4 和 DMT1）的表達呈正相關，與 GPX4 和 FSP1 呈負相關。GO 和 KEGG 富集分析表明，機械應力影響鐵死亡相關通路。1 MPa  的機械應力 以時間依賴性方式顯著改變了細胞形態、細胞內 Fe2+ 以及鐵代謝和鐵死亡蛋白水平。

進一步利用Piezo1抑制劑GsMTx4 或鐵死亡抑制劑（Fer-1）處理，發現GsMTx4 減輕了機械應力誘導的損傷，通過阻斷 Piezo1 減少了鐵積累，表明 Piezo1 參與了 NPCs 的鐵過載。此外，1 MPa 刺激顯著促進了 NPCs 的細胞死亡，而GsMTx4 和 Fer-1 減輕了這種影響。通過收集NP樣本確定 IVD 退變是否涉及鐵過載，發現退行性 NP 組織中的鐵水平增加。免疫組化結果顯示，Piezo1 和鐵死亡相關基因 ACSL4 在高度退變患者中上調，而 GPX4 下調，這與機械應力刺激的結果一致。

然后測量 ROS 的水平。結果表明，機械應力提高了 ROS 的生成，而 GsMTx4 處理減少了 ROS 的產生（圖1 a）。TEM顯示，機械應力影響了線粒體結構，線粒體收縮且嵴雜亂，而抑制Piezo1 減輕了這種影響（圖1 b）。測定線粒體的功能和生物標志物的表達，發現機械應力會干擾，而抑制 Piezo1 則在無 Ca2+ 的環境中維持了線粒體的功能（圖1 c-e、i）。

據報道，Piezo1 在多種情況下促進鐵死亡。因此，評估了 Piezo1 激活在 NPCs 鐵死亡改變中的作用。RT-PCR和 WB分析顯示，1 MPa 刺激改變了鐵代謝標志物（TFRC、DMT1、FPN、FTH1、Hepcidin）和鐵死亡標志物（NRF2、GPX4 、FSP1、ACSL4 ）的表達。然而，GsMTx4 減弱了機械應力對鐵代謝相關基因、鐵死亡基因和蛋白質的影響（圖1 f、g），而Fer-1 僅恢復鐵死亡標志物的表達，這說明，Fer-1 不能有效阻止機械應力誘導的鐵代謝變化（圖1 h）。此外，在 1 MPa 機械應力下，陽性鐵死亡標志物轉鐵蛋白受體（TFRC）表達降低，脂質 ROS 水平顯著增加且被 GsMTx4 抑制（圖1 j-l）。這些數據表明，機械應力通過激活 Piezo1 影響鐵死亡。

圖1    機械應力通過 Piezo1 激活影響鐵死亡。

接下來，研究了機械應力誘導的 NPCs 變化，在不含 Ca2+ 的培養基中用 Yoda1（Piezo1 的激動劑）培養細胞（圖2 a）。結果表明 Yoda1 改變了與鐵代謝和鐵死亡相關的基因水平（圖2 b-d）。GO、KEEG 和 GESA 分析還表明，Piezo1 激活影響鐵穩態，表明藥物或機械應力引起的 NPCs 中鐵代謝和鐵死亡的變化是相似的（圖2 e-g）。

因此，評估了 Piezo1 是否直接或間接影響鐵內流。利用檸檬酸鐵銨（FAC）構建細胞外鐵過載環境，用 Yoda1 或 GsMTx4 處理大鼠 NPCs（圖2 h、i）。結果顯示，Piezo1 的化學激活顯著破壞了細胞骨架和細胞間連接（圖2 j）。此外，FAC 增加了細胞內 Fe2+ 和丙二醛（MDA）水平，尤其是在 Yoda1 存在的情況下，而GsMTx4 阻止了 Fe2+ 的大量內流。這種趨勢在某種程度上獨立于 Ca2+，因為在不含 Ca2+ 的培養基中也檢測到鐵的積累（圖2 k-m）。活/死測定顯示，Yoda1 顯著促進 NPCs 細胞死亡，GsMTx4 顯著減輕了這一現象（圖2 n）。CCK-8 結果還顯示，鐵環境破壞了細胞活力，而 Yoda1 以時間依賴性方式大大加速了細胞死亡（圖2 o）。上述結果表明，Piezo1 通道的藥理學激活顯著增加鐵過載。

進一步將大鼠原代 NPCs 暴露于高鐵環境中，并用 Yoda1 或 GsMTx4 處理，評估 ROS 產生、脂質 ROS、線粒體結構、功能和生物標志物。TEM 分析顯示，Piezo1 激活影響線粒體結構，而Piezo1 的抑制劑減輕了鐵刺激的有害影響。DCFDA 測定顯示，Yoda1 提高，而 GsMTx4 減少了 ROS 的產生。此外，Yoda1 導致 NPCs 功能紊亂，而 Piezo1 的抑制在高鐵環境中大大改善了這些影響。值得注意的是，TFRC 在高鐵環境中上調，而 GsMTx4 略微降低表達。流式細胞術分析表明，Piezo1 通道激活后脂質 ROS 水平顯著增加。由于 GsMTx4 是 Piezo1 的非特異性激動劑，因此在 GsMTx4 存在下用 Yoda1 和 FAC 處理細胞，WB 和熒光染色圖像顯示，在 Yoda1 和 FAC 存在下，用 GsMTx4 或 si-Piezo1 阻斷 Piezo1 通道減弱了 Yoda1 的作用。這些結果表明，Piezo1 通道介導的鐵過載導致線粒體功能障礙、氧化應激和脂質過氧化，其激活在鐵死亡發生中起重要作用。

圖2    Piezo1 通道的藥理學激活顯著增加了鐵過載。

TFRC 參與細胞內鐵元素的轉運過程，是鐵內流因素。使用 Tfrc-siRNA 轉染敲低 Tfrc（KD）以研究 Piezo1 是否可以獨立于 TFRC 直接促進鐵內流。令人驚訝的是，Tfrc KD 并沒有保護受機械應力處理的細胞的正常形態。Tfrc KD 并沒有緩解壓縮應力誘導的 Fe2+ 內流、MDA 和 ROS 增加以及線粒體功能障礙。此外，鐵代謝相關標志物和鐵死亡標志物的改變并未得到緩解。

有趣的是，轉染后在高鐵環境中用化學藥物刺激NPCs 時，其對 FAC 刺激變得不敏感，細胞內 Fe2+ 和 MDA 水平降低證明了這一點。Tfrc KD 逆轉了 FAC 刺激的 Fe2+ 內流、ROS 增加、線粒體膜電位和線粒體功能障礙，且在蛋白質水平上減輕了 FAC 造成的損傷。然而，在高鐵環境中使用 Yoda1 處理后，這些表型沒有改變。盡管如此，即使在 Tfrc-siRNA 轉染后，Yoda1 和機械應力組仍然表現出相同的鐵代謝相關標志物和鐵死亡標志物變化。值得注意的是，Yoda1 處理在正常或無鈣培養基中顯著誘導鐵過載，表明 Fe2+ 可以通過 Piezo1 通道轉移到細胞質中。這些結果表明，Piezo1 誘導的鐵內流與 TFRC 無關。

最后，為了評估 Piezo1 通道的基因阻斷是否減弱體內的 IVDD 過程，建立了針刺小鼠模型（圖 3 a）。研究發現，Piezo1 可干擾 GPX4 表達和鐵死亡，表明 Piezo1 可能通過 GPX4 調控 IVDD。因此，使用 WT、Gpx4-cKO、Piezo1-cKO 和 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠建立針刺尾骨 IVDD 模型以供進一步分析。結果顯示，Piezo1 缺失減弱了 IVDD 的發展，而 Gpx4 的缺失顯著促進了 IVDD 的發展。然而，IVDD 在 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中比在 Piezo1-cKO 小鼠中更嚴重。Micro-CT 顯示，Gpx4-cKO 小鼠退變嚴重。然而，敲除 Piezo1 可減輕 IVDD（圖3 b、c）。

此外，番紅素O 染色顯示，Piezo1 缺失顯著保留了組織學完整性和 ECM（圖3 d），以及代謝生物標志物的表達。然而，Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中 Gpx4 的額外缺失消除了在 Piezo1-cKO 小鼠中檢測到的 IVDD 的緩解（圖3 e）。此外，免疫熒光染色檢測鐵代謝和鐵死亡指標（ACSL4、DMT1、FSP1）的表達，發現保護性標志物 FSP1 的熒光強度在 Piezo1-cKO 小鼠中增強，而在 Gpx4-cKO 和 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中降低。相比之下，ACSL4 和 DMT1 的熒光強度顯示出相反的趨勢（圖3 f-i）。qPCR 結果顯示，Gpx4 在 Piezo1 敲低細胞和 Piezo1-CKO 小鼠中增加，但 Gpx4-CKO 和 WT 小鼠之間的 Piezo1 表達水平無顯著差異。這些結果表明，Piezo1 可以通過影響 GPX4 來調控 IVDD 進展（圖4）。

圖3    Piezo1 通道的缺失通過 GPX4 減弱了 IVDD 的發展。

圖4    鐵代謝模式示意圖。（a）正常條件下細胞的鐵代謝模式。

（b）機械應力下細胞的鐵代謝模式

綜上所述，該研究表明，機械應力誘導的 Piezo1 激活在鐵代謝和鐵死亡的調節中起著至關重要的作用。這一結論基于三個主要發現。首先，Piezo1 通道的激活導致細胞內鐵過載，最終以應力反應方式導致鐵死亡。其次，Piezo1 通道的激活以不依賴 TFRC 的方式直接介導鐵內流，這可能發生在早期階段，伴隨著 TFRC 的反饋下調。第三，Piezo1 或其抑制劑 GsMTx4 的缺失可以逆轉鐵過載，Piezo1-鐵-鐵死亡軸可能是機械應力誘導疾病的一種新型治療方法。

參考文獻：Xiang Z, Zhang P, Jia C, Xu R, Cao D, Xu Z, Lu T, Liu J, Wang X, Qiu C, Fu W, Li W, Cheng L, Yang Q, Feng S, Wang L, Zhao Y, Liu X. Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx. Bone Res. 2024 Mar 29;12(1):20. doi: 10.1038/s41413-024-00317-9. PMID: 38553442; PMCID: PMC10980708.

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