水分是藥品常用的檢測項目, 常應用于原料藥或其制劑的檢查, 在藥品檢測領域有著廣泛的應用, 已為各國藥典廣泛收載。檢測實驗室進行水分測定的水平可以客觀地、較有代表性地反映出該實驗室的藥品檢測能力。藥品中水分測定的影響因素較多, 如費休氏試液的標定液滴定度的影響、溶劑用量及溶解時間的影響、稱樣量的影響、滴定儀器的影響等, 需要較高的技術能力^[1]。

能力驗證是實驗室質量保證體系中的一個重要組成部分。參加能力驗證活動是評價實驗室檢測水平, 鍛煉人員技術能力, 促進實驗室認可和交流的重要手段^[2]。我國在檢測和校準實驗室的國家認可制度中對實驗室參加能力驗證并取得滿意結果提出了明確的要求^[3]。

本次研究通過組織藥品中水分測定的能力驗證計劃可以使參加實驗室了解國內藥品及其他相關檢測領域的整體水平, 為這些領域的管理和CNAS的認可提供信息;同時也可以使參加實驗室識別實驗室間存在的差異, 促進實驗室共同提高水平;CNAS也可以通過比對, 發現、分析并解決問題, 監控認可實驗室檢測能力的維持情況^[7,8,9,10]。檢測方法參照中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, “水分測定法”第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。

鑒于藥品水分的質量控制要求, 本研究對國內166家藥品、獸藥等檢測機構的藥品水分測定能力進行測試, 研究水分測定能力驗證的樣品制備、均勻性與穩定性、結果統計、能力評價等情況, 并對測試結果進行討論。

1 儀器與試藥

廈門群隆卡氏水分儀  ;無水甲醇 (分析純, ) ;費休氏試液 (分析純, ) ;純化水。樣品來源為市售進口品牌 (Fluka試劑) 分析純試劑。

2 方法

2.1 測試樣品制備

本次能力驗證研究采用單一樣品設計, 樣品為酒石酸二鈉二水合物, 該物質不吸水, 也不失水, 具有良好的穩定性, 美國藥典作為標化費休氏滴定液的標準物質或用于水分測定的質控物質。在溫度為 (25±2) ℃、相對濕度≤50%的環境下, 將樣品分裝到透明玻璃瓶中, 用鋁蓋壓緊密封。共制備樣品250瓶, 每瓶裝量約為1.0 g。分裝后的樣品按照單盲樣品分配表分配, 向每個參加者提供1份白色粉末樣品。

2.2 樣品均勻性和穩定性檢驗

在所有樣品中, 以隨機方式抽取10瓶樣品用于均勻性檢驗, 對于抽取的每瓶樣品, 在重復性條件下測試3次。檢測方法參照中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, “水分測定法”第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。

取完整包裝的樣品各6瓶, 分別置于 (1) 室溫條件下 (濕度:50%以下) ; (2) 40℃、75%RH條件下; (3) 25℃、92.5%RH條件下;在第0 d取 (1) 條件下樣品3瓶;在第10 d取 (2) 、 (3) 2個條件下樣品各3瓶、第30 d取 (1) 、 (2) 、 (3) 條件下樣品各3瓶進行穩定性考察。每瓶在重復性條件下測定3次。

2.3 測定要求

能力驗證研究對每個參加實驗室隨機安排一個唯y1性代碼, 代碼為001至166, 向每個參加實驗室發送樣品1瓶, 同時附有作業指導書、結果報告單和被測物品接受狀態確認表等, 要求各參加實驗室按照作業指導書進行測定, 并在規定期限內上報測試結果。測試結果以%為單位, 結果保留4位有效數字。

2.4 結果統計分析方法

依據CNAS制訂的分析實驗室能力驗證的統一要求^[4], 能力驗證采用穩健 (Robust) 統計技術處理實驗室的檢測結果。即采用穩健統計的中位值作為值, 標準化四分位距 (NIQR) 為變動性度量值 (目標標準偏差) 計算各實驗室結果的Z比分數 (Z值) 。根據單一樣品的結果計算實驗室Z比分數。

按下式計算Z值:

式中:x-參加者測試結果;X-值;NIQR-標準化四分位距。

涉及的統計量有結果數、中位值及其不確定度、標準化四分位距 (NIQR) 、穩健的相對標準偏差 (RSD) 、小值、大值和極差等。

Z比分數評價實驗室的結果, 即:若∣Z∣≤2, 檢測結果為滿意結果;若2<∣Z∣<3, 檢測結果為有問題結果;若∣Z∣≥3, 檢測結果為不滿意結果或離群值。

3 結果與統計分析

3.1 測試樣品均勻性檢驗結果

隨機抽取本次能力驗證樣品10瓶, 按中國藥典2010年版二部附錄ⅧM, 第y1法 (費休氏法) , A (容量滴定法) 測定水分。每瓶樣品在重復性條件下測定3次。采用單因子方差分析法 (one way ANOVA) ^[5]對檢驗結果進行統計處理, 結果表明在置信度95%時樣品的均勻性均滿足要求。

臨界值:F_{0.05 (9, 20)} =2.39, 統計量F小于此值。這表明在α=0.05顯著性水平時, 樣品是均勻的。

3.2 測試樣品穩定性檢驗結果

取完整包裝的樣品各3瓶, 按“2.2”項下的試驗條件進行樣品水分的穩定性考察。采用t檢驗法^[5]評價樣品在3個條件下第n d和第0 d (均勻性檢驗樣品) 水分測定結果的一致性。結果表明, 兩者間無顯著性差異, 樣品的穩定性滿足要求。

查表得在顯著性水平α=0.05, 自由度為37 (n₁+n₂-2) 時t_0.05, 37的臨界值為2.026, 樣品水分測定值的統計量t均小于該臨界值。這表明在此顯著水平時, 樣品在3個條件下放置10 d、30 d與第0 d均勻性實驗時的水分測定結果無顯著性差異, 即經過加速穩定性考察的樣品與均勻性檢驗的樣品結果無顯著性差異。

從發送樣品到實驗室收到樣品并完成檢驗不超過30 d時間, 且這段時間中樣品于常溫條件下保存, 樣品的穩定性能滿足要求。

3.3 藥品水分測定能力驗證結果

提交檢測結果的實驗室共166家, 將所有水分測定結果繪制頻率分布圖。從圖1可見, 樣品的檢測結果基本呈單峰分布, 峰形大致對稱。基于這種數據分布, 依據規定^[6], 適合采用穩健統計方法評價各參加實驗室的測試結果。

關于值的計算, FAPAS優先采用的是計算參加實驗室的Huber Robust均數, 而國內普遍采用的是NATA和CNAS推薦的中位值法^[11]。其實, 當數據為單峰和大致對稱時, 中位值或Huber Robust均數的數值是相近的。本次能力驗證采用CNAS推薦的穩健統計中位值法^[4]。

圖1 參加實驗室檢測結果頻率分布圖

穩健統計方法是一種不易受到異常值影響的統計方法。在通常采用的統計方法中, 計算一組數據的平均值 (mean) 容易受到異常值影響, 而在穩健統計方法中, 是以中位值 (median) 代替平均值, 以歸一化IQR代替標準偏差。因此能準確反映出數據的統計特征。

提交結果的166家實驗室參與了統計, 其中139家的結果為滿意, 16家的結果有問題, 11家的結果為不滿意。

能力驗證的結果通常可使用Z比分數柱狀圖表示, 見圖2, 該圖不但能幫助組織者解釋結果, 對于參加者也非常有用, 特別對那些帶有離群值的參加者, 能夠看到他們提交的結果與其他實驗室結果的差異, 從而對實驗室能力進行評估。

圖2 實驗室Z比分數柱狀圖

4 技術分析和建議

根據王君等^[12]發表的“費休氏水分測定法的不確定度評定”一文中的各個不確定度分量并結合本次能力驗證各參加單位的結果報告, 共篩選出了以下幾個方面闡述費休氏水分測定的技術難點。

4.1 費休氏試液的標定

費休氏試液的標定, 中國藥典是選用純化水精密稱定后用費休氏試液滴定進行標定, 標定應取3份以上, 且3次連續標定的結果其相對標準偏差應在1%以內, 方能進行供試品水分的測定。

從結果來看, 共27家參加者的結果可疑或不滿意, 其中有5家標定數據的相對標準偏差超過1%, 有的甚至高達3.74%, 說明標定過程沒有達到穩定狀態, 這樣計算得出的F值是不準確的, 這可能是導致終結果偏差的直接原因;另有部分實驗室未提供標定數據, 無法考證其標定的準確性, 這也反映部分實驗室在日常的實驗過程中沒有很好地關注這個關鍵步驟。

文獻報道^[12]水的重量引入的不確定度分量大, 占結果不確定度的66%以上, 且水的重量要求達到10 mg以上, 才能得到可靠結果。個別參加者在標定時稱取純化水的量低于10 mg, 而中國藥典規定標定時取純化水10~30 mg, 取樣量減少也可能導致結果的不準確性增大, 導致了能力驗證結果為不滿意。

4.2 滴定度的影響

費休氏試液滴定度太低或太高對滴定的準確性也有一定的影響, 當滴定度較低時, 需要消耗大量的滴定液, 使滴定時間延長, 在滴定過程中也可能更多地引入空氣中的水分, 從而影響結果的準確性;滴定度太高有可能使消耗的滴定液過少, 滴定體積的微量變化就可能影響結果, 造成偏差。本次各參加實驗室費休氏試液的滴定度大多為3~5 mg·m L^-1, 但有個別實驗室的滴定度較低, 消耗滴定液的體積大于5 m L, 若滴定管體積為5 m L, 則多次讀數將引入誤差, 已經產生錯誤操作, 其結果必然影響準確性。

4.3 稱樣量的因素

文獻報道^[12]第三大不確定度分量是樣品的稱樣量, 占結果不確定度的6.4%。作業指導書推薦供試品取樣量為70~90 mg, 是考慮到應使消耗的費休氏試液在一定體積范圍之間方能準確測定, 但是仍有個別實驗室取樣量過低, 有的甚至為20 mg, 過低的取樣量直接導致消耗的費休氏試液量過低或與純化水的標定所消耗的費休氏試液量相差太大, 從而引入的不確定度分量增大, 使結果不滿意。

4.4 溶劑用量及溶解時間的影響

供試品在溶劑中是否*溶解直接影響到水分測定的結果, 作業指導書中明確告知各實驗室“本品在甲醇中微溶”, 但有部分實驗室沒有關注其溶解性的問題, 在供試品取樣量為70~90 mg的情況下, 無水甲醇的用量有20 m L、10 m L甚至5 m L的, 過低的溶劑量有可能造成供試品沒有*溶解, 從而影響水分測定的結果。另有部分實驗室沒有提供無水甲醇的用量, 也說明實驗室沒有充分考慮到溶劑溶解性的問題。另外如果樣品加入溶劑后直接測定, 溶解時間不充分的話也會影響檢測的準確性和穩定性。部分結果不滿意及可疑的實驗室原始記錄上也未能體現溶解時間, 這可能造成3份結果之間偏差過大或結果偏離的原因之一。

4.5 滴定儀器

有個別參加者采用較老式的玻璃水分測定儀 (手動滴定) , 這種儀器對人員的操作技術要求較高, 由于放置樣品的容器與空氣不*隔絕, 當環境濕度較大, 人員操作較慢, 人員對終點判斷的準確性有欠缺, 以及由于系統不密閉情況下滴定液容易吸收空氣中的水分等諸多因素都會影響結果的準確性, 終導致結果可疑或不滿意。

另外, 水分的測定對卡氏水分儀器的密封性能要求很高, 新購的卡氏水分儀密封性能較好, 但隨著使用時間的延長, 密封程度會有所變化:密封圈的老化, 干燥劑的失效, 長時間不使用導致儀器內部管路、滴定瓶、溶劑等吸附環境水分, 使測定過程出現終點延長, 重現性差, 結果偏大等一系列問題, 所以實驗室應該注重儀器日常的維護保養及檢定、校準、期間核查等工作, 在使用前也應及時更換干燥劑或在必要時更換密封圈等。