中文名稱：SW116-LUC人大腸癌熒光素酶標記細胞 培養步驟
規格：T25
形態特征：
生長狀態：成纖維細胞樣
特征特性：貼壁生長
培養條件：DMEM(高糖）+10%FBS（推薦BI優等胎牛血清貨號：04-001-1acs）
傳代方法：消化3-5分鐘。1:2。3天內可長滿。
凍存條件無血清凍存液規格：100ML
支原體檢測：陰性
使用權限：A類
參考文獻：
供應商：上海琛藝實業有限公司
復蘇周期：10個工作日左右
 
培養步驟：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL*培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
 
1、對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的*培養基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。
4. 按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。
PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內，嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養瓶或6cm培養皿，加入5ml左右*培養基混勻，放入培養箱過夜培養后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續培養，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。

SW116-LUC人大腸癌熒光素酶標記細胞 培養步驟

三、    母細胞來源  ATCC

四、    轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染 

(一)     質粒部分

pLVX-luc慢病毒穿梭質粒由本公司構建并保存。 

(二)     慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天， 293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用磷酸鈣轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的pLVX-luc質粒15μg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。 

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。 

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于200μl離心管中，-80℃保存。 

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天，消化HCT-116細胞并計數，將細胞鋪于6孔板中（以便在感染前細胞達到20%-40%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。

2.(Day1) 解凍低溫保存的慢病毒液，加病毒液（滴度為109）1μl加入細胞中，向每孔加入Polybrene達到終濃度8ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

3.(Day2)12小時后移去含有慢病毒的培養基，加入2000μl*培養基。

4.(Day4后)按照HCT116正常培養細胞方法培養。 

五、    培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;杭州四季青公司）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，碧云天公司）的高糖DMEM培養基培養（Hyclone公司），培養三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

【注意事項】該細胞比較好養，國產的血清和培養基即可。這個細胞比較容易消化，0.25%的胰酶，大概消化半分鐘就可以吹打下來了。 

六、    細胞傳代所需時間：3天/代 

   七、實驗數據：熒光值達到107

   皮下移植瘤: 5×106的細胞數注射于一只雄性裸鼠背部皮下1周后成像。熒光紙達到107

   尾靜脈注射肺轉移：5×106的細胞數注射于一只雄性裸鼠尾靜脈后4week后成像。熒光紙達到107
 

(二)     慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15μg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500μl離心管中，-80℃保存。

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化SMMC7721細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度），37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200μl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500μl*培養基。

5.(Day4)換液，加入300μg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300μg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

維持培養。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100μg/ml Hygromycin維持培養。

8. SMMC7721-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

五、    培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

六、    細胞傳代所需時間：3天/代 

七、    篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。

八、    體外實驗數據：

1. 7721-Gluc 和7721-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)： 

2. 細胞裂解液的發光值，數據—化學發光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。

九、    體內試驗：（2-5）×106皮下接種1-2周成瘤，2周可達4-5mm大 小