一、    細胞名稱   ：Saos-2-LUC人成骨肉瘤熒光素酶標記細胞 處理步驟

二、    組織  人骨肉瘤細胞

三、    母細胞來源  ATCC

四、    轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染G418篩選 

(一)     質粒部分

1.酶切載體：pGL3-SV40-luc使用NheⅠ和XBaⅠ內切酶37度過夜酶切，切下為1400bp的luc基因片斷；同時 plenti-neo使用speⅠ內切酶37度過夜單酶切。

2.電泳和膠回收：plenti-neo切開后加CIAP去磷酸化，37℃，30min；將片段luc和載體plenti-neo進行DNA電泳，再用TAKALA試劑盒膠回收，回收產物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc片段和plenti-neo線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉化：感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。

6.小抽質粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質粒用SpeⅠ內切酶37℃，2h單切，由于目的基因插入后speⅠ酶切位點發生融合，故不能切開者可鑒定為構建成功的質粒。

7.熒光素表達鑒定: 重組質粒plenti-neo-luc 轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染plenti-neo-luc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質粒plenti-neo-luc（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中，室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內，37 ℃、5 % CO2條件下培養，8小時后換培養液。

8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質粒中抽：取1ml轉染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產物電泳鑒定，－20℃保存。

(二)  Saos-2-LUC人成骨肉瘤熒光素酶標記細胞 處理步驟

   慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天， 293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的plenti-neo-luc質粒15μg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500μl離心管中，-80℃保存。

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化Soas2細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200μl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500μl*培養基。

5.(Day4)換液，加入500μg/ml  G418來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，500μg/mlG418維持培養。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中500μg/mlG418維持培養。

8. Soas2-luc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

五、    培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

【注意事項】有專家感覺用αMEM培養基效果更好。

六、    細胞傳代所需時間：3天/代 

七、    篩選標記維持壓力和選擇壓力：G418 200ug/ml 和500ug/ml 。

八、    體外實驗數據：

九、    體內實驗 ：

植瘤: 1×106的細胞數分別注射于兩只雄性，周齡和體重相似的裸鼠的背部皮下。

成像: 提前0.5h打開活體成像儀，把要拍攝的腫瘤部位周圍的鼠毛用8％Na2S脫去以使成像結果更清晰，然后給小鼠腹腔注射熒光素（luciferase的底物，每只注射3mg，稀釋于200ul生理鹽水中），等待10min使酶和底物充分反應后將小鼠置于通有異氟烷氣體的麻醉箱內麻醉，有必要可調整空氣與異氟烷氣體的流入量。小鼠*被麻醉后，關閉通入麻醉箱的麻醉氣體，打開通入成像儀暗箱的麻醉氣體通道，將小鼠放置于暗箱平臺中（小鼠頭應嵌入異氟烷流入槽內，防止其中途醒來影響成像結果）。di一次拍攝為有外加照明光源存在情況下的小鼠形體背景圖；第二次拍攝是無外加光源下拍攝的小鼠體內發出的生物發光，Expose時間為6×105ms（可調節），第二次生物發光的圖像與di一次背景圖疊加后可清晰地觀察到小鼠發出生物發光的位置，熒光強弱。*用軟件計算出光源區域的單位光子數，獲取和整理圖像和處理數據。