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質(zhì)譜鑒定常見問題解答

來源:上海希言科學(xué)儀器有限公司   2018年06月19日 10:17  

1. 一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜有什么區(qū)別?什么時(shí)候做一級,什么時(shí)候做二級?

答:一級質(zhì)譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜(PMF),即利用質(zhì)譜儀測量酶解片段的分子量并搜庫比較實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定,二級質(zhì)譜是在一級質(zhì)譜的基礎(chǔ)上再選擇部分肽段做進(jìn)一步的破碎并對碎片進(jìn)行深入分析和比較,鑒定出該肽段的序列并結(jié)合PMF的結(jié)果從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。二級質(zhì)譜能夠得到部分肽短的序列,具有更高的可靠性。隨著現(xiàn)在雜志對數(shù)據(jù)的要求越來越嚴(yán)格,二級質(zhì)譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢,而且即使目前做一級質(zhì)譜鑒定的結(jié)果,也需要挑選部分PMF結(jié)果做二級質(zhì)譜驗(yàn)證。

2. 研究的物種不是模式生物怎么辦?

答:可以參考親緣關(guān)系近的模式生物做比對而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成功鑒定,如果質(zhì)譜圖很好而沒有鑒定結(jié)果說明這是一個(gè)全新的蛋白,可以采用de-novo等技術(shù)做深入分析與鑒定。

3. 該如何評價(jià)質(zhì)譜效果的好壞?

答:做PMF一般得分超過60分(P<0.05)就算成功鑒定,而串聯(lián)質(zhì)譜,得分超過60分或者雖然沒有超過60分,但是有少一條肽段的得分超過30分就算成功鑒定。

4. 一些特殊的質(zhì)譜方法有什么用途?

答:質(zhì)譜的其它用途包括磷酸化位點(diǎn)分析、蛋白測序、混合蛋白鑒定(shotgun技術(shù))以及分子量測定、二硫鍵位置分析等等。

5. 用什么染色方法比較好?

答:hao用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色,銀染也可以,但鑒定成功率稍低,并且推薦用串聯(lián)質(zhì)譜對銀染蛋白進(jìn)行鑒定可以大大提高鑒定成功率。

6. 凝膠是否可以長期保存?該如何保持?對鑒定效果有影響嗎?

答:如果保存時(shí)間超過一個(gè)月,可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持,如果小于一個(gè)月,則可以常溫保持,不會影響質(zhì)譜鑒定效果。

7. 質(zhì)譜鑒定取膠點(diǎn)該如何取?有什么注意事項(xiàng)?

答:取點(diǎn)的時(shí)候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點(diǎn),用槍頭將凝膠戳取下來并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中,用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次,后吸干離心管中所有水分封蓋保存。水用去離子水或者雙蒸水;取點(diǎn)的時(shí)候帶好口罩與手套,以免角蛋白污染。

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