簡介

在室溫下分子大都處在基態的zui低振動能級，當受到光的照射時，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來的基態能級躍遷到*電子激發態或更高電子激發態中的各個不同振動能級，這就是在分光光度法中所述的吸光現象。躍遷到較高能級的分子，很快通過振動弛豫、內轉換等方式釋放能量后下降到*電子激發態的zui低振動能級，能量的這種轉移形式，稱為*躍遷。再由*電子激發態的zui低振動能級下降到基態的任何振動能級，并以光的形式放出它們所吸收的能量，這種光便稱為熒光。

圖 1. 熒光機理（Jablonski 圖）熒光分析法是測定物質吸收了一定頻率的光以后，物質本身所發射的光的強度。物質吸收的光，稱為激發光。物質所發射的光，稱為發射光或熒光。如果將激發光用單色器分光后，連續測定相應的熒光強度所得到的光譜，被稱為該熒光物質的激發光譜。選取激發光譜中zui大吸收峰處的波長，固定波長檢測物質所發射的熒光的波長和強度，所得到的曲線稱為該物質的熒光發射光譜。激發和發射光譜是熒光物質定性的依據。對于某一熒光物質的稀溶液，在一定波長和一定強度的入射光照射下，當液層的厚度不變時，所發生的熒光強度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎。為獲得*數據，儀器參數的設定尤其重要。在本技術指南中，對Lumina儀器參數的含義進行說明，同時說明設定值變更和熒光光譜變化之間的相關性。

儀器參數

PMT：光電倍增管電壓，可增加熒光強度。PMT的設定值越高，熒光強度就越高，不過噪聲信號也會增加；因此，可根據樣品適當調整。狹縫：可調整光束寬度，光束寬度越寬，到達樣品的光束越多，熒光強度也會增加。發射波長間隔：檢測樣品時，可設定波長間隔。如設定為0.1nm，光束的照射密度會很密，會使檢測時間變長。積分時間：檢測樣品時按照波長間隔向樣品照射光束的時間。假設在400～600nm范圍內進行發射掃描，積分時間為20ms，如將間隔設為0.1nm，熒光檢測步驟如下：400nm波長下，照射20ms；400.1nm波長下，照射20ms；400.2nm波長下，照射20ms。也就是說，隨著積分時間的增加，在各波長下照射光束的時間也會增加，使得掃描速率 (nm/min) 變慢，熒光強度增加。

標準樣品：

•熒光素 (3×10^-6 M)

上述參數可根據樣品進行調整。

圖 2. 熒光素的分子結構

•蒽 (1×10-5 M)

圖 2. 熒光素的分子結構

2.Lumina熒光分光計

3.Luminous軟件

4.熒光比色皿（光程 10 mm）

實驗步驟

按照*的儀表參數對標準樣品（熒光素、蒽）進行檢測后，邊更改儀表參數設定，邊確認熒光光譜的變化。

1.檢測標準樣品的激發、發射光譜

2.檢測不同PMT值下的發射光譜熒光強度變化

3.檢測不同狹縫值下的發射光譜熒光強度變化

4.檢測不同積分時間值下的發射光譜熒光強度和掃描速率變化

5.檢測不同發射波長間隔對掃描速率和熒光光譜的影響

6.檢測不同掃描速率對光譜的影響

7.檢測不同響應時間對光譜的影響

結果

1.標準樣品的激發、發射光譜

圖4為按照圖5所示儀表參數進行檢測的熒光素激發、發射光譜。

圖 4. 熒光素 3×10^-6  M 的激發光譜（紅色）和發射光譜（黑色）

圖 5. 儀器參數設置

2.不同PMT 值對發射光譜的影響

如圖6所示，隨著熒光素PMT電壓的增加，熒光強度會增加。

圖7為不同狹縫寬度下熒光強度的變化。通過狹縫寬度的變更，可調整激發光和放射光的量。通過實驗可以看出變更狹縫寬度對熒光強度的影響大于變更PMT值對熒光強度的影響。e="宋體" >電壓的增加，熒光強度會增加。

圖 7.不同狹縫寬度對熒光強度的影響

4.不同積分時間對發射光譜及掃描速度的影響增加積分時間，即增加光束照射樣品的時間，發射光強度會增加，還可確認熒光掃描速率也會發生變化。

圖 8. 不同積分時間下的熒光強度及掃描速率值的變化

5.不同發射波長間隔下發射光譜的變化Lumina的熒光光譜掃描速度設置為用戶自定義時，積分時間、平均數、掃描間隔可以按照自己的意愿進行設定。增加發射波長間隔時，檢測間隔會增加，故掃描速率會加快。當掃描速率加快時，如圖9所示，光譜 FWHM 變寬。

 圖9. 不同發射波長間隔時對熒光強度及掃描速率值影響

 6.不同掃描速率對發射光譜的影響其他參數不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜FWHM變寬。

總結

儀表參數的設定會對光譜數據產生巨大的影響。根據樣品類型、濃度及純度，儀表參數的設定值應會有所不同，檢測員需根據樣品類型和狀態，變更儀表參數的設定值，以求獲得*的光譜條件。erun:'yes';font-family:'Times New Roman';" > 其他參數不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜FWHM變寬。