一． 樣品的RNA抽提（Trizol，Invitrogen）
1、樣本處理
1）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 離心管中，加入 1ml Trizol ，混勻，室溫靜置 5min。
2）組織：每50 - 100mg組織樣品，用液氮研磨成粉末，加入1 ml的TRIZOL試劑，混勻，室溫靜置 5min。
2、兩相分離
每1 ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩管體，室溫靜置 5min。4°C下12,000 ×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無(wú)色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
3、RNA沉淀
將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入1 ml TRIZOL試劑的此時(shí)加0.5 ml的異丙醇。混勻后15到30°C孵育10分鐘后，于4°C 12,000 ×g離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
4、RNA清洗
移去上清液，每1 ml TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4°C 7,500 ×g離心5分鐘。
5、重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5 - 10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要*干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260 / 280比值將小于1.6。溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60°C孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于- 70°C。
二． RNA濃度與純度測(cè)定
取1μlRNA樣品稀釋100倍后測(cè)定RNA濃度及OD260、OD280。純的RNAOD260/280在1.8～2.0之間。樣品RNA濃度計(jì)算公式為：A260 X 稀釋倍數(shù)×40 ng/ul。
三． RT（PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real Time，Takara）
1、按下列組份配制RT反應(yīng)液
5×PrimeScript Buffer | 2 μl |
PrimeScript® RT Enzyme Mix I | 0.5μl |
Oligo dT Primer（50 μM）*1 | 0.5μl |
Random 6 mers（100 μM）*1 | 0.5μl |
Total RNA | 0.5ng |
RNase Free dH2O | Up to 10μl |
2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min，85℃ 5 sec。
3、反應(yīng)結(jié)束后，將其放在冰上待用或-20℃保存。
四． qPCR（SYBR Premix Ex Taq，Takara）
1、按下列組份分別配制Realtime PCR反應(yīng)體系。
SYBR Premix Ex Taq | 12.5 μl |
PCR Forward Primer（10 μM） | 0.5 μl |
PCR Reverse Primer（10 μM | 0.5 μl |
DNA模板 | 1.0 μl |
dH2O（滅菌蒸餾水 | 10.5 μl |
Total | 25μl |
輕彈管底將溶液混合，5000 rpm短暫離心。
2、步驟1配置的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。
95℃，5min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；79℃，20秒（收集熒光））。
為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，（95℃，2min；60℃，20秒；72℃，20秒；99℃，15秒，并從72℃緩慢加熱到99℃（8分鐘）。
3、結(jié)果與計(jì)算
各樣品的目的mRNA和內(nèi)參（GAPDH）分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2 - △△ CT法進(jìn)行分析
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