簡介抗生素曾被廣泛用于獸藥生產中，用于預防和治 療 疾 病 及 促 生 長 劑等?？股氐臑E用最終導致牛奶、肉類等動物源性食品中抗生素殘留量嚴重超標，對人們健康帶來風險?？股氐臍埩魰е露靖狈磻邕^敏反應、皮疹。另外，長期攝入抗生素殘留的食品，會導致抗藥性細菌的傳播。因此，各國都實施了動物抗生素使用法規。例如，歐盟和加拿大制定了食品中藥物最高殘留量（MRL），美國將其稱為耐受水平。法規規定牛奶中抗生素殘留種類包括磺胺類、β內酰胺類、氟喹諾酮類、大環內酯和四環素。本文中牛奶里各類抗生素的*如表 1 所示
本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測定方法?？股胤N類包括環丙沙星、環丙沙星、氧氟沙星、青霉素 G、氯唑西林、替米考星、泰樂菌素、紅霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、四環素和金霉素。以及兩種同位素內標為環丙沙星 -d8 和氟尼辛-d3。采用改良的 QuEChERS 方法對牛奶中抗生素進行提取。本方法具有良好的線性，高靈敏度、回收率穩定、重現性高和特異性強的特點，滿足各國監管機構規定的牛奶中抗生素類殘留*的要求
實驗方法儀器設備Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統， 含 Altus A-30溶 劑 管 理 模 塊、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱。 質 譜 儀：Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質譜儀。Simplicity3Q ™軟件平臺控制所有儀器、采集和處理數據。
方法參數液相色譜方法以及質譜離子源參數見表 2。溶劑、標準物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級?？股貥藴饰镔徸?Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存。除了 β- 內酰胺類使用水作為溶劑外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內酰胺類標準溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素類標準溶液可保存在塑料或玻璃瓶中從 C18 凈化劑購于 Supelco 公司。所有母液和工作標準溶液均冷藏保存，并使用 2mL 的棕色進樣小瓶，以防止化合物降解。同位素內標的使用：環丙沙星-d8用于氟喹諾酮，磺胺類和四環素類，氟尼辛-d3用于大環內酯和β-內酰胺類。
采用當地市場購得有機牛奶作為空白樣品，并對不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進行抗生素殘留檢測。采用簡單改良過 QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機牛奶（已添加標準，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機溶劑（甲醇或乙腈）；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min；（3）移取上清液，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪；（4）渦旋 5min，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液，于 40℃用氮氣吹至 1.5- 2mL；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過 0.22µm PVDF 微孔濾膜。本實驗采用基質匹配標準曲線進行定量分析，待上述步驟 7 完成后在進行基質配標及添加內標，基質標準曲線范圍在 0.1ng/mL-1000ng/mL，每個濃度點重復進樣 5 次，進行精密度實驗。
譜參數優化本實驗研究的目標化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測。采用蠕動泵和液相色譜儀相結合，以三通連接的方式來優化質譜參數：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置。蠕動泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質譜，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V，10/90，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質譜中。每個化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來優化碰撞能量。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個化合的質譜參數詳見表 3，每個化合物均采集 3 對 MRM 離子對，以降低假陽性或假陰性結果
結果與討論按照上述確定的實驗方法進行測試，各各個抗生素的校準曲線相關系數及 LOQ 見表 4。各個抗生素的 LOQ 比法規中耐受水平還要低至 5-100 倍。實驗結果表明，本方法*牛奶中抗生素的檢測要求。圖 1 為牛奶基質加標樣品（濃度為5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出，具有較高的信噪比。采用空白牛奶基質作為稀釋液，配制一系列濃度的標準曲線工作液（9 個濃度點），基質配標曲線范圍為 0.1-1000ng/mL。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準曲線示例，線性范圍大于 4 個數量級。所有抗生素化合物的校準曲線線性相關系數 R2 均大于 0.9958，具有良好的線性關系。表 5 為目標化合物在不同濃度下連續進樣的重現性數據
表 6 展示了牛奶樣品加標回收的實驗結果。大環內酯類、磺胺類和 β- 內酰胺類抗生素回收率在 70-120% 之間，重現性 RSD 值小于 20%（n=5）。氟喹諾酮的絕對回收率為 60-70%，但四環素的絕對回收率相對比較低，回收率為 30%。同位素內標的回收率：環丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3 分別約 70% 和 90%。氟喹諾酮和氘代氟喹諾酮化合物在提取過程中會出現類似損失，故使用同位素內標來校正氟喹諾酮來化合物的回收率。采用環丙沙星 -d8 作為氟喹諾酮和四環素類的內標物，對提取過程的回收率進行校正。使用內標校正后氟喹諾酮的回收率范圍為 80-110%，而四環素約為 30%。在今后的實驗中可采用氘代四環素作為四環素內標會得到更好的實驗結果。表 6 還展示了不同溶劑的沉淀蛋白效果對回收率和基質效應的影響。除了紅霉素外，其余目標化合物在乙腈和甲醇中的回收率相近，而紅霉素采用乙腈和甲醇提取的回收率分別約為 27% 和 98%。本文采用溶劑配制標準溶液與牛奶基質配制標準溶液的響應值之間進行比較，以獲得牛奶基質效應情況。結果表明：無論甲醇還是乙腈提取樣品，磺胺類、大環內酯類和 β- 內酰胺類化合物未見明顯的基質效應。氟喹諾酮和四環素均有基質增益的效應，相對而言，兩者在甲醇提取的基質增益更為顯著。利用上述確定的實驗條件，分析了5個不同脂肪含量（1%到 5%）的牛奶樣品。實驗結果表明，5 個牛奶樣品均未檢出抗生素。兩種內標化合物在不同脂肪含量的樣品中，其回收率 RSD 值均小于 15%，這表明：化合物回收率與牛奶中的脂肪含量關系不大。本實驗對每個化合物均監測了 3 對 MRM 離子對，其中 2 對 MRM 離子對
用于化合物的定性確證。相對僅有一對離子豐度比，擁有兩對 MRM 的離子對豐度比的實驗，具有更高的選擇性和特異性。定性離子的峰面積與定量離子峰面積比值，作為離子豐度比。表 7 展示了目標化合物在牛奶基質中的平均離子豐度比。不同濃度水平下的相對離子比在平均離子豐度比 ±11% 之間，低于食品中化學殘留物分析SANCO 文件 5 規定 ±30% 的允許誤差范圍。往牛奶空白樣品提取液中添加標準品，磺胺類、氟喹諾酮類和 β- 內酰胺類的加標濃度為 10ng/mL，大環內酯類和四環素類化合物的加標濃度為 50ng/mL，對系統進行長達 6 天的穩定性實驗。圖 3 展示了牛奶基質中10ng/mL 磺胺二甲嘧啶與內標物響應值進行歸一化的數據。在連續 6 天進樣，磺胺二甲嘧啶響應值未見明顯下降。實驗表明，該三重四極桿質譜儀系統具有優異穩定性。在 6 天的長期穩定性測試顯示 13 種抗生素中有 10 種抗生素的信號強度無減弱。另外 3 種抗生素隨著時間推移而降解，導致信號強度降低 30%。
結論 參考文獻本文采用改良型 QuEChERS 樣品前處理方法建立了牛奶中抗生素類多殘留分析方法，該方法具有快速、穩定、可靠，高靈敏度和選擇性等特點。經簡單的樣品前處理，大部分抗生素化合物獲得了良好的回收率。本方法滿足牛奶中痕量的抗生素殘留進行定性定量分析要求，具有良好的精密度和穩定的保留時間。長期穩定性測試結果表明：該 LC/MS/MS 系統適用于長期復雜基質的樣品分析，也無需停機維護保養
17
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務