01
寡核苷酸合成
寡核苷酸是連接在一起形成單鏈生物聚合物很短的單鏈或雙鏈核酸片段，分為脫氧核糖核酸和核糖核酸的短序列。寡核苷酸是通過化學合成的，常用的合成方法是固相亞磷酰胺三酯法。合成路線如圖1，第一步：去除固相載體5’-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5’-羥基；第二步：將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5’-羥基發生縮合反應；第三步：將上一步反應中的未能加入新堿基的活化堿基被醋酸酐酸化，這一過程稱為戴帽，這些戴帽的堿基不會參與到后續的合成循環中。第四步：通過氧化劑，第一個堿基與被成功偶聯的第二個堿基之間的亞磷酸酯鍵將會被氧化成穩定的磷酸三酯鍵，以維持不斷增長的鏈。
圖1寡核苷酸合成過程
（點擊查看大圖）
02
寡核苷酸的鑒定
寡核苷酸的化學合成過程中不可避免的會產生n-1、n-2等更短序列的雜質，因此需要對合成的寡核苷酸進行純化鑒定。因為寡核苷酸樣品中的鹽會影響其離子化過程和造成峰強度降低，所以必須進行樣品除鹽處理后再進質譜檢測器鑒定。相比離線除鹽方法，在線除鹽方法更加省時省力。我們利用賽默飛新型Vanquish duo液相色譜系統（圖2）聯用質譜檢測器Thermo Scientific™ LTQ XL開發了雙柱交替（圖3）在線高通量除鹽并鑒定的應用。雙柱交替當柱A正在做脫鹽和分析時，與此同時，柱B正在活化再生和平衡等待進樣。然后雙柱角色互換，如此循環往復。
圖2 Vanquish Duo液相色譜系統
圖3 智能雙柱交替流路鏈接示意圖
（點擊查看大圖）
色譜條件
色譜柱：DNAPac™ RP（2.1×10 mm 4µm）
柱溫：40℃
進樣量：1 µL；
流動相：A：0.5% HFIPA和0.05% DIEA的水溶液B：10%的A+90%甲醇溶液
表1.右泵平衡泵梯度方法
（點擊查看大圖）
表2.左泵分析泵梯度方法
（點擊查看大圖）
分析結果
圖4為寡核苷酸樣品的總離子流圖，圖5和圖6分別為對應的原始質譜圖和去卷積后的圖。從圖7序列中每一針進樣時間間隔可知，該方法分析周期實為1min（含進樣、取樣前洗針、取樣后洗針、脫鹽、分析、采集質譜數據），一天按24小時計算的話，可以分析1440個寡核苷酸樣品，可以滿足快速、高通量分析的要求。本法無需單獨為柱A和柱B分別建立方法，全程只有一個方法，真正實現智能雙柱交替在線除鹽。從表3中寡核苷酸分子量理論值與實測值比較可知，偏差在0~100ppm之間，化合物匹配失敗的除外。這兩個匹配失敗的樣品是根據分子量偏差和質譜數據綜合判斷的。
圖4 寡核苷酸樣品的總離子流圖
（點擊查看大圖）
圖5 寡核苷酸樣品原始質譜圖
（點擊查看大圖）
圖6 去卷積后的圖
（點擊查看大圖）
圖7 進樣間隔1min的序列截圖
（點擊查看大圖）
表3.理論分子量與實測分子量對比
點擊查看大圖）
03
寡核苷酸的用途
寡核苷酸產品有著廣泛的應用，不僅在基礎研究方面，還包括醫學診斷、法醫學和農業科學等各大領域，設計基因表達、基因分型、克隆、分子診斷及作為藥物治療各種疾病。下表是已上市獲批的寡核苷酸藥物統計情況，我們可以看出寡核苷酸藥物領域逐漸火熱的勢頭。
17
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務