諾博萊德 細菌總RNA提取試劑盒(帶gDNA過濾器）

FlashPure Plus Bacteria Total RNA Mini Kit細菌總 RNA 快速提取試劑盒（含 gDNA 過濾器）

目錄號：91413

產品內容

自備試劑

無水乙醇

保存條件

rong菌酶，常溫運輸， 4℃保存；其他組分，室溫（15 ~ 25℃）保存。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介

FlashPure Bacteria Total RNA Mini Kit 是專用于提取細菌（G+、G-）的總 RNA，采用高效的 gDNA 過濾器，不需要繁瑣的 DNase I 消化過程。得到的 RNA，可直接用于 RT、RT-PCR、RT-qPCR、RACE、測序、芯片等。

產品特點

1. 無毒：免氯仿、免β-巰基乙醇！

2. 高質：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！

3. 高效：提取全過程僅需 10 min！

重要提示：

① 第一次使用前，請先在漂洗液 RW 中加入無水乙醇，詳見瓶身的標簽。

② 每次操作前，請先配制添加了rong菌酶或者 Lysostaphin 的 TE (PH 8.0)，終濃度為 1mg/ml。

③ 所有離心步驟均需要在室溫（15~25℃）下進行。

操作步驟：

1. 離心收集 1 ~ 2 ml 菌液（10⁸ ~10⁹細胞）到一個 1.5 ml 離心管, 徹di吸棄上清。

2. 根據細胞的種類和數量，充分重懸細胞在 100 μl (5x10⁸細胞) / 200 μl

( 5x10⁸~7.5x10⁸ 細胞 ) TE 中（確保rong菌酶或者 Lysostaphin 已添加至 TE 中，濃度為 1mg/ml )，或者直接用 TE 重懸后，用干凈槍頭挑取少許rong菌酶加入。

3. 室溫(15~25℃)溫育5min/rong菌酶, 或者37℃溫育15min/ Lysostaphin，破解細胞壁。每 2 min 渦旋振蕩 10 sec，幫助破壁。

注意：各種細菌破壁的難易程度不一樣，一般革蘭氏陰性菌 E.coli 使用上面的條件就足夠了，,甚至可能省略該步驟，但是某些革蘭氏陽性菌如B. subtilis 難破壁需要提高rong菌酶濃度到 15mg/ml 和溫育時間到10min。如果金黃色葡萄qiou菌需要加入 lysostaphin 到 1mg/ml，37℃溫育 15min。總之不同細菌類型破壁難易程度不同，有的難破壁的種類需要根據用戶自己的具體情況調節酶的種類、工作濃度和溫育溫度、時間，此外還可以聯合使用玻璃珠擊打，機械破壁，蛋白酶 K 消化等方法幫助破壁。

4. 短暫離心收集細菌，徹di吸棄上清后，加入 500 μl 裂解液 BRL Plus，渦旋震蕩或者反復吹打，裂解細菌。

5. 將裂解勻漿液全部加到 gDNA 過濾器中（過濾器放入收集管中），13,000 rpm 離心 1 min，保留濾液，（RNA 在濾液中）。

6. 向濾液中加入等體積（通常為 500 μl）的 70%乙醇，立即吹打混勻。

7. 每次轉移≤750 μl 濾液混合物至 RNA 吸附柱中（吸附柱放入收集管)，13,000 rpm 離心 1 min，倒棄濾液。此時，RNA 被吸附在膜上，重復此過程，直到溶液全部上柱。

8. 加入 700 μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 1min,13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

9. 加入 500 μl 漂洗液 RW，13,000 rpm 離心 30 sec，倒棄濾液。

10. 重復步驟 7。

11. 把 RNA 吸附柱放回收集管中，13,000 rpm 離心 2 min，徹di除去膜上的乙醇。

12. 取出 RNA 吸附柱，放入新的 RNase-free 1.5 ml 離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加 30-50μl RNase-Free H2O（事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產量），室溫放置 1 min，13,000 rpm 離心 1 min。

13. 得到的 RNA，可直接用于下游實驗，或于-70℃保存，以免降解。

附錄：

一、免液氮直接研磨（自動研磨儀）——適用于新鮮樣本

a. 在 2.0 ml 液氮研磨管中加入 4 mm 兩粒，加 600 μl 裂解液 ARL plus，放進 20 mg 左右的樣本，設置 65 個頻率，震蕩 2 min。

b. 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。

二、液氮研磨（自動研磨儀）:

a. 把研磨模塊丟到液氮中預冷，直到沒有氣泡冒出視為預冷完畢。

b. 在 2.0 ml 液氮研磨管中放入 3mm 鋼珠 3 粒，放進 20-30mg 樣本，

投入液氮中預冷。

c. 把預冷好的離心管插入研磨模塊中，放進研磨儀，設置 55 個頻率，震蕩 30~60 sec。（以北京赫得研磨儀——京 N9548 為例）

d. 研磨完成后，馬上加 600 μl 裂解液 ARL Plus，劇烈渦旋振蕩,充分混勻。

e. 將裂解物 13,000 rpm 離心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。

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