PCR程序設置和什么有關？影響大么？

一旦確定了合適的DNA起始量和PCR組分，就必須設定PCR循環(huán)和運行參數(shù)，從而確保高效擴增。

DNA聚合酶的特點、PCR緩沖液的類型、模板DNA的復雜程度都會影響反應條件的設置。

1、起始高溫變性步驟

在PCR起始階段，通常是在94–98℃下孵育1-3min將雙鏈DNA模板解離成單鏈，從而使引物可與目標區(qū)域結(jié)合并開始延伸。

此步的高溫條件使起始DNA變性，確保在第一個擴增循環(huán)期間實現(xiàn)有效的目標序列擴增，此外也有助于使樣品中可能存在的熱不穩(wěn)定性蛋白酶或核酸酶失活，從而保證它們極小影響熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。

同時，當使用熱啟動DNA聚合酶時，此步同時可以激活該聚合酶。

起始變性步驟，該步驟的時間和溫度取決于模板DNA的性質(zhì)和緩沖液的鹽濃度。

例如，哺乳動物基因組DNA可能比質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物需要更長的孵育時間（具體取決于DNA的復雜程度和大小）。

同樣，高GC含量（如， >65%）的DNA通常需要更長的孵育時間或更高的溫度。高鹽濃度的緩沖液（滿足某些DNA聚合酶的需要）同樣需要更高的變性溫度（如，98℃），以使雙鏈DNA解離。

在95℃以上長時間孵育，很容易使Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶變性。為彌補在該步驟中酶損失的活性，可能需要在起始變性步驟后添加更多的酶，或在一開始加入多于建議用量的DNA聚合酶。高度熱穩(wěn)定的酶(如來自Archaea的酶)能夠耐受長時間高溫孵育，在整個PCR過程中保持活性。

2、循環(huán)變性步驟

起始變性步驟后，后續(xù)PCR循環(huán)以一個獨立的變性步驟開始，并在94–98℃條件下持續(xù)0.5-2min。

與起始模板DNA變性步驟一樣，該步驟的時間和溫度也可根據(jù)模板DNA、DNA聚合酶和緩沖液成分的性質(zhì)進行優(yōu)化。

例如，更長時間和/或高溫條件對長片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的。

甘油、DMSO、甲酰胺和甜菜堿等添加劑的存在，可促進變性步驟期間雙鏈DNA的解離并提高特異性，從而無需長時間或高溫條件。

3、引物退火步驟

在該步驟中，目的是降低反應溫度，使引物與目標DNA結(jié)合。

通常，0.5-2min的孵育時間足以供引物完成退火。通過計算PCR擴增引物的熔解溫度（Tm），可確定退火溫度。根據(jù)一般經(jīng)驗法則，起始退火溫度比引物低至Tm低3–5℃。

Tm指50%的引物與其互補序列形成雙鏈時的溫度，可通過多種方法進行計算。引物Tm估算簡單的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸數(shù)量進行計算，公式如下：Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)。

由于反應的鹽濃度 (Na?) 會影響引物退火，因此，使用以下公式能夠更加準確地計算Tm：Tm=81.5+16.6(log[Na?]) + 0.41(%GC)–675/引物長度。

Tm計算需考慮的一個重要因素是PCR添加劑、輔助溶劑和修飾核苷酸的使用。這些試劑的存在會降低引物-模板復合物的Tm。

例如，10%DMSO會使退火溫度降低5.5–6.0℃。同樣，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也會降低Tm。此時，應相應調(diào)整退火溫度。

7-Deaza-dGTP是一種人工合成的dGTP類似物，可作為大多數(shù)DNA聚合酶(包括Taq DNA Polymerase)的底物。

與dGTP相比，7-Deaza-dGTP具有更高的電子親和力化學穩(wěn)定性，這使得它在DNA合成反應中更容易被酶識別和嵌入，從而提高了DNA合成的效率和準確性。7-Deaza-dGTP摻入DNA后可影響DNA的熒光染色和電泳遷移率；與dITP相比，7-Deaza-dGTP提升了長序列區(qū)域的易讀性。

7-Deaza-dGTP替代或部分替代dGTP擴增富含GC的DNA序列，可提升有效降低PCR反應錯誤率，提高PCR產(chǎn)物產(chǎn)量，使DNA測序更加簡單高效，廣泛應用于富含GC的DNA序列的PCR擴增、測序和基因克隆等生物實驗，在疾病診斷中發(fā)揮重要作用。

應注意，計算所得 Tm 值就是引物退火的起始參考溫度。退火溫度可能需要根據(jù)擴增結(jié)果進行進一步優(yōu)化。

例如，如果結(jié)果為無擴增條帶或擴增水平很低，則優(yōu)化時應以2–3℃增量逐漸降低退火溫度。但是，如果出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物，則以2–3℃增量逐漸提高溫度（最高至延伸溫度），提高特異性。

4、引物延伸步驟

引物退火后，便是延伸引物的3'末端，產(chǎn)生模板的互補鏈。該步中，DNA聚合酶的5'→ 3'聚合酶活性引入dNTP并合成子鏈。

反應溫度升高至酶的最佳溫度（熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳溫度通常為70–75℃），使其達到最高活性。

如果引物退火溫度與延伸溫度相差不超過3℃，則退火和延伸溫度可合并為一步，稱為兩步PCR法。兩步PCR法無需在退火和延伸之間轉(zhuǎn)換和穩(wěn)定溫度，從而縮短了PCR所需的時間。

PCR的延伸時間取決于DNA聚合酶的合成速度以及目標DNA的長度。

Taq DNA聚合酶的一般延伸時間是1min/kb，而 Pfu DNA聚合酶為2min/kb。因此，“緩慢型"聚合酶比“快速型"聚合酶需要更多的擴增時間，才能獲得相等的得率。

同樣，長DNA擴增子比短DNA需要更長的延伸時間，才能實現(xiàn)全長復制。當擴增長目的片段（如， >10 kb）時，除了需要增加延伸時間，還需要降低PCR溫度，以確保引物結(jié)合并在長時間循環(huán)中維持酶活性。

5、PCR循環(huán)數(shù)設置

為擴增目標DNA，需重復PCR的變性、退火和延伸步驟多次。循環(huán)數(shù)通常為25-35次，具體取決于DNA起始量和所需的目標PCR產(chǎn)物得率。

如果DNA起始量少于10拷貝數(shù)，則可能需要多達40個循環(huán)，才可獲得足夠的得率。不建議使用超過45個循環(huán)，因為過多的循環(huán)數(shù)會產(chǎn)生非特異性條帶。而且，副產(chǎn)物的累積和反應組分的消耗會大大降低PCR效率，使PCR擴增曲線出現(xiàn)平臺期。

相反，較少的循環(huán)數(shù)更適合于無偏倚擴增（如下一代測序）以及目標DNA的準確復制（如克隆）。

6、最終延伸步驟

最后一個PCR循環(huán)完成后，即為最終延伸步驟。該步中，將PCR混合物在延伸溫度（通常為72℃）下最后孵育5-15min。其持續(xù)時間取決于擴增子長度和組成，以確保全長復制以及高目標DNA片段得率。

在該步驟中，除了填補不完整末端外，Taq DNA 聚合酶等具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性的DNA聚合酶還會在PCR引物的3'末端添加額外的核苷酸。

因此，如果PCR擴增子被克隆到TA載體中，建議最終的延伸步驟持續(xù)30min，以確保生成合適的3'-dA尾部結(jié)構以實現(xiàn)有效的PCR克隆。

參考文獻：

［1］PCR循環(huán)參數(shù)—成功的六大關鍵因素-賽默飛

［2］7-Deaza-dGTP (10mM, for GC-Rich PCR/Sequencing)-碧云天

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