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杭州實(shí)了個(gè)驗(yàn)生物科技有限公司
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賽默飛（Thermo Fisher）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是現(xiàn)代分子生物學(xué)中常用的分析工具之一，其廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原檢測(cè)、突變檢測(cè)等研究領(lǐng)域。特別是其7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System），以其精確的溫控系統(tǒng)、靈敏的熒光信號(hào)檢測(cè)能力、以及用戶友好的操作界面，成為許多實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備。以下是關(guān)于7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的詳細(xì)使用步驟和原理說(shuō)明。
1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)介
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是一種高靈敏度的基因擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的DNA擴(kuò)增。其基本原理是在PCR反應(yīng)中加入帶有熒光標(biāo)簽的探針或染料，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，推測(cè)出目標(biāo)DNA的初始數(shù)量。與傳統(tǒng)PCR不同，實(shí)時(shí)PCR能夠在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的數(shù)量，因此可以獲得更為精準(zhǔn)的定量數(shù)據(jù)。
2. 賽默飛7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀概述
賽默飛7500型PCR儀采用先進(jìn)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)和精密的溫控系統(tǒng)，能夠提供高度精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其主要特點(diǎn)包括：
多通道熒光檢測(cè)：7500型儀器具有多達(dá)6個(gè)熒光通道，支持不同熒光探針或染料的同時(shí)檢測(cè)，適用于多重PCR反應(yīng)。
高效的熱循環(huán)系統(tǒng)：儀器采用精密的熱循環(huán)技術(shù)，溫控精度和均勻性較高，能夠確保擴(kuò)增反應(yīng)的高效進(jìn)行。
用戶友好的操作界面：7500型PCR儀配備大尺寸觸摸屏，操作界面直觀，支持?jǐn)?shù)據(jù)實(shí)時(shí)顯示、分析與報(bào)告生成。
3. 設(shè)備安裝與準(zhǔn)備
在使用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之前，首先需要完成設(shè)備的安裝和調(diào)試工作。這些步驟包括：
3.1 安裝與檢查
位置選擇：選擇一個(gè)穩(wěn)定、無(wú)強(qiáng)電磁干擾和溫度波動(dòng)的地方來(lái)放置PCR儀器。避免直射陽(yáng)光和震動(dòng)，確保設(shè)備的穩(wěn)定性。
設(shè)備連接：連接電源線、計(jì)算機(jī)（如果需要）和網(wǎng)絡(luò)（如有需要）。確保所有連接無(wú)松動(dòng)。
3.2 啟動(dòng)與自檢
打開(kāi)設(shè)備電源，設(shè)備會(huì)自動(dòng)進(jìn)行自檢。此過(guò)程是為了確保硬件系統(tǒng)的正常運(yùn)作，檢查如熱循環(huán)系統(tǒng)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)等關(guān)鍵部件。
檢查液晶屏是否正常顯示，儀器是否能夠順利進(jìn)入操作界面。
4. PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備
4.1 樣品和試劑準(zhǔn)備
DNA模板：提取所需的DNA模板，通常需要在PCR前進(jìn)行核酸純化，確保模板的純度和濃度適合實(shí)驗(yàn)要求。
引物和探針：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)特異性的引物和探針。設(shè)計(jì)時(shí)需注意引物的長(zhǎng)度、GC含量、退火溫度等因素，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。
PCR反應(yīng)混合物：PCR反應(yīng)體系一般包括模板DNA、引物、探針、熒光染料（如SYBR Green或TaqMan探針）、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整反應(yīng)體系的組成。
4.2 配制反應(yīng)液
按照試劑盒說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)配制PCR反應(yīng)液，保證每個(gè)反應(yīng)孔中加入合適量的反應(yīng)液和模板。
一般來(lái)說(shuō)，反應(yīng)液的總量可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置，通常每個(gè)反應(yīng)孔的體積為20-50 μL。
4.3 樣品的加載
將配制好的反應(yīng)混合物和模板按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分配到PCR板的各個(gè)孔中。確保每個(gè)孔的液體量一致，并且避免產(chǎn)生氣泡。
樣品加載完成后，使用PCR板封膜，確保密封良好。
5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序設(shè)置
5.1 創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)
在7500型PCR儀的觸摸屏上，選擇“新建實(shí)驗(yàn)"選項(xiàng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求設(shè)置反應(yīng)條件，如擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、退火溫度、熒光通道等。
選擇合適的PCR反應(yīng)體系類型，例如SYBR Green染料體系或TaqMan探針體系。
5.2 設(shè)置PCR程序
熱啟動(dòng)：大多數(shù)PCR反應(yīng)體系需要在初始階段進(jìn)行熱啟動(dòng)，以激活DNA聚合酶，避免非特異性擴(kuò)增。
擴(kuò)增程序：設(shè)置適合的擴(kuò)增程序，通常包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。對(duì)于SYBR Green染料體系，通常需要一個(gè)較長(zhǎng)的退火/延伸時(shí)間來(lái)確保信號(hào)的準(zhǔn)確檢測(cè)。
數(shù)據(jù)采集：在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時(shí)，選擇熒光信號(hào)采集時(shí)間點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)時(shí)PCR儀會(huì)在延伸步驟后進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)的采集。
5.3 啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)
在確認(rèn)所有參數(shù)設(shè)置無(wú)誤后，點(diǎn)擊“開(kāi)始"啟動(dòng)PCR實(shí)驗(yàn)。儀器將根據(jù)設(shè)置的程序自動(dòng)進(jìn)行反應(yīng)。
6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與數(shù)據(jù)處理
6.1 實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，7500型PCR儀會(huì)實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增曲線和熒光數(shù)據(jù)。用戶可以隨時(shí)查看實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和熒光信號(hào)變化。
在PCR反應(yīng)過(guò)程中，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。通過(guò)熒光信號(hào)的閾值設(shè)置，可以確定擴(kuò)增的起始點(diǎn)（Ct值）。
6.2 數(shù)據(jù)分析
Ct值分析：通過(guò)分析不同樣品的Ct值，可以確定目標(biāo)基因的表達(dá)量或DNA的初始拷貝數(shù)。Ct值越小，表示樣品中目標(biāo)基因的初始濃度越高。
標(biāo)準(zhǔn)曲線：為了定量測(cè)定目標(biāo)基因的相對(duì)或絕對(duì)表達(dá)量，可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)該曲線來(lái)計(jì)算樣品中目標(biāo)基因的濃度。
相對(duì)定量分析：在基因表達(dá)分析中，通常采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Ct值，可以得出目標(biāo)基因在不同樣本中的相對(duì)表達(dá)水平。
6.3 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與報(bào)告生成
實(shí)驗(yàn)完成后，用戶可以通過(guò)設(shè)備的分析軟件導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并生成報(bào)告。報(bào)告中包含擴(kuò)增曲線、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線等相關(guān)數(shù)據(jù)。
7. 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與故障排除
7.1 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
模板質(zhì)量：模板的質(zhì)量直接影響PCR的結(jié)果，應(yīng)確保模板無(wú)污染且濃度適中。
引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)不合理可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性擴(kuò)增，因此設(shè)計(jì)時(shí)要保證引物的特異性和二聚體形成的最小化。
反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系需要根據(jù)試劑和樣品的具體情況進(jìn)行優(yōu)化，以提高擴(kuò)增效率和信號(hào)的靈敏度。
7.2 常見(jiàn)故障與解決
無(wú)擴(kuò)增或擴(kuò)增信號(hào)弱：可能是模板量不足、引物設(shè)計(jì)不合理、PCR條件設(shè)置不當(dāng)?shù)葐?wèn)題導(dǎo)致。應(yīng)檢查模板質(zhì)量、引物特異性及PCR程序設(shè)置。
非特異性擴(kuò)增：可以通過(guò)優(yōu)化引物退火溫度或使用特異性更強(qiáng)的探針來(lái)避免非特異性擴(kuò)增。
熒光信號(hào)偏低：可能是染料添加量不足、熱循環(huán)條件不合適等原因?qū)е隆z查熒光染料的濃度和PCR反應(yīng)條件。
8. 總結(jié)
賽默飛7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以其高精度的溫控系統(tǒng)和靈敏的熒光檢測(cè)能力，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原檢測(cè)、基因變異分析等研究領(lǐng)域。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和合理設(shè)計(jì)反應(yīng)體系，研究人員可以獲得高質(zhì)量的定量PCR數(shù)據(jù)。
