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怎樣用恒溫培養(yǎng)箱做提蛋白及蛋白定量的濃度實(shí)驗(yàn)?

閱讀:2687        發(fā)布時(shí)間:2017/9/6
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1、吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。

2、往培養(yǎng)皿中加入2ml 冷的PBS輕輕蕩洗2~3次,zui后一次,吸干培養(yǎng)皿中的PBS。

3、每個(gè)培養(yǎng)皿中加入70μl(以FLS細(xì)胞為例)裂解液。

裂解液的配置:

RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物:RIPA裂解液(中)B液=100:1:1

(配置時(shí)實(shí)際配置的體積需比理論值高出幾十微升)

4、將加入裂解液的培養(yǎng)皿輕輕搖晃,使裂解液與貼壁細(xì)胞充分接觸,放入—70℃的冰箱,冷凍10分鐘。

5、裂解完后,用干凈的刮刀將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一處(動(dòng)作要快,每個(gè)皿控制在3min),然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行)

6、將離心管置于小型離心機(jī)上渦旋一下,然后置于4℃冰箱放置30min。(期間從冰箱拿出再進(jìn)行渦旋一次)

7、將離心管放入高速離心機(jī),于4度下12000rpm 離心5min。(提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)

8、取出離心管,吸取上清液,上清液即蛋白液,對(duì)其進(jìn)行定量,轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管。(定量需用的槍。)

9、對(duì)提取的上清液進(jìn)行蛋白濃度的定量

蛋白定量的過(guò)程

①取干凈的96孔板,進(jìn)行區(qū)域選擇板底掃描即讀板(切勿用手觸摸板底)

②首先在96孔板中加入18ul的PBS(做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的PBS)

③在18ul的PBS中加入2ul的樣品

④zui后在加入200ul的BCA(加入后的BCA不進(jìn)行與樣品的混合,而是鋪在樣品的上面,用吹風(fēng)機(jī)除去上方的氣泡)

         BCA的配置: BCA試劑A:BCA試劑B=50:1

⑤放置37°恒溫培養(yǎng)箱孵育30min

⑥讀板(吸光光度值為562)

10、對(duì)剩余的樣品按照體積5:1的比例加入Loading Buffer(6X)

11、將加好的樣品放入離心機(jī)順離,使離心管內(nèi)壁的樣品甩下。

12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min

13、將煮好的蛋白放入—20℃冰箱中備用(在離心管壁上標(biāo)記好樣品名稱(chēng)、日期)

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