超氧陰離子自由基檢測試劑盒(磺胺微板法)
一、產(chǎn)品簡介：
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交聯(lián)或者斷裂，引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞， 與機體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。生物體內(nèi)的分子氧可以經(jīng)過單電子還原轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子自由基(O2-)，O2-既可以直接作用于蛋白質(zhì)和核酸等大分子，也可以衍生為羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫及脂質(zhì)過氧物自由基等對細胞結(jié)構(gòu)和功能具有破壞作用的活性氧。
雅吉生物超氧陰離子自由基檢測試劑盒(磺胺微板法)又稱超氧陰離子產(chǎn)生速率檢測試劑盒，其檢測原理是在酸性條件下，2 份O2-與羥胺反應(yīng)生成 1 份 NO2-，NO2-在對氨基苯磺酸和萘胺的作用下反應(yīng)生成粉紅色的偶氮物質(zhì)，以酶標儀測定 530nm 處吸光度，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與 O2-成正比，根據(jù) A530 及 NO2-和 O2-的相關(guān)反應(yīng)中物質(zhì)的量的關(guān)系，可算出樣品中O2-的濃度。該試劑盒主要用于測定植物組織中的超氧陰離子自由基含量或超氧陰離子的產(chǎn)生速率及清除能力。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
二、產(chǎn)品組成：
名稱規(guī)格 | 100T | 存儲 |
試劑(A): NO2-標準(1mM) | 1ml | 4℃ |
試劑(B): O2- Lysis buffer | 250ml | 4℃ |
試劑(C): 羥胺溶液 | 5ml | 4℃ |
試劑(D): 氨基苯磺酸顯色液 | 5ml | 4℃ 避 光 |
試劑(E): 萘胺顯色液 | 5ml | 4℃ 避 光 |
使用說明書 | 一份 | |
三、自備材料：
1、蒸餾水
2、實驗材料：植物組織(大豆、綠豆、玉米等葉片)、血液、組織樣本等
3、研缽或勻漿器
4、離心管或試管
5、低溫離心機
6、恒溫箱或水浴鍋
7、酶標儀、96 孔板
四、操作步驟(僅供參考)：
1、準備樣品：
①植物樣品：取正常或逆境下的新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，切碎，迅速稱取 1~1.5g， 加入 2ml 預(yù)冷的O2- Lysis buffer 后冰浴條件下勻漿或研磨，4℃ 10000g 離心 10min，上清液即為超氧陰離子自由基提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，4℃保存，用于超氧陰離子自由基的檢測。
③高活性樣品：如果樣品中含有較高濃度的超氧陰離子自由基，可以使用 O2- Lysis buffer 進行恰當?shù)南♂尅?/span>
2、配制系列 NO2-標準溶液：取出 NO2-標準(1mM)恢復(fù)至室溫后，以 NO2-標準(1mM) 按下表繼續(xù)稀釋：
加入物(μl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
NO2-標準(1mM) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
蒸餾水 | 99 | 98 | 97 | 0.96 | 95 | 94 |
NO2-含量(μM) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
3、O2-加樣：按照下表設(shè)置空白孔、標準孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的超氧陰離子自由基濃度過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置平行孔。
加入物(μl) | 空白孔 | 標準孔 | 測定孔 |
蒸餾水 | 100 | — | — |
系列 NO2-標準(1~6 號) | — | 100 | — |
待測樣品 | — | — | 25 |
O2- Lysis buffer | — | — | 25 |
羥胺溶液 | — | — | 50 |
混勻，25℃水浴孵育 20min。 | |||
氨基苯磺酸顯色液 | 50 | 50 | 50 |
萘胺顯色液 | 50 | 50 | 50 |
混勻，30℃水浴孵育 30min。 | |||
4、O2-測定：以空白調(diào)零，酶標儀測定標準孔、測定孔 530nm 處吸光度(即為
A標準、A測定)。
五、計算：以系列 NO2-標準(1-6 號孔)含量(μM)為橫坐標，以對應(yīng)的吸光度為縱坐標，制作標準曲線，根據(jù)測定孔的吸光度進而計算 NO2-含量。根據(jù)如下公式計算具體樣品中超氧陰離子自由基(O2-)的含量：
植物組織樣品 O2-(μM/g)=2×n×VT/(W×VS)
血清、尿液等樣品 O2-(μM/ml)=2×n×N/VS
超氧陰離子的產(chǎn)生速率的定義：每分鐘每克鮮重組織產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量，計算公式如下：
超氧陰離子產(chǎn)生速率【μmol/(min*g)】=2×n×VT/(W×t×VS)
測得樣品中蛋白質(zhì)含量后，可用下面公式表示：
超氧陰離子產(chǎn)生速率【μmol/(min*mg)】=2×n×VT/(m×t×VS)
式中：2=NO2-與O2-間的化學(xué)計量數(shù)
n=從標準曲線上查得的 NO2-含量(μM) VT=超氧陰離子自由基提取液總體積(ml) N=樣品稀釋倍數(shù)
W=樣品鮮重(g)
m=樣品中蛋白質(zhì)含量(mg)
t=樣品與羥胺的反應(yīng)時間(min)=20 VS=測定時加入提取液體積(ml)
六、注意事項：
1、 實驗材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即使用，應(yīng)存于 4℃。
2、 如果樣品中含有較多的葉綠素，會干擾測定結(jié)果，可在加入羥胺溶液 25℃水浴孵育20min 萃取葉綠素，再行顯色反應(yīng)。
3、 如果沒有酶標儀，也可以使用普通的分光光度計測定，但應(yīng)考慮最小檢測體積。
4、 所測樣本的濃度過高，應(yīng)用 O2- Lysis buffer 稀釋樣品后重新測定。
5、 氨基苯磺酸顯色液和萘胺顯色液有強烈的刺激性，盡量在通風(fēng)條件好的地方操作，用后需擰緊瓶蓋，避免揮發(fā)。
七、有效期：6 個月有效。4℃運輸，4℃保存。
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