Lipo2000試劑的使用范圍較廣，它不僅可以用于質(zhì)粒DNA轉染、siRNA表達載體、雙鏈核糖核酸dsRNA轉染, 以及RNA等核酸轉染，還可以用于文庫篩選的高通量轉染。對于細胞轉染Lipo 2000幾乎涵蓋了HEK293、CHO細胞、HeLa等190多種細胞系。本期內(nèi)容一起來學習下Lipofectamine™ 2000瞬時轉染的實驗流程吧！
(一)細胞轉染前的準備:
因轉染效率依賴于細胞培養(yǎng)密度，而Lipo2000脂質(zhì)體轉染試劑具有細胞毒性，使用時需確保高細胞密度進行，建議根據(jù)細胞生長速度提前種板并使用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉染時細胞呈對數(shù)生長并達到80%-90%匯合，有助于獲得最高轉染效率和表達水平，且能最小化高轉染活性導致的細胞生長降低影響。（可通過預實驗觀察細胞對試劑毒性的耐受程度調(diào)整細胞密度。）
(二)DNA準備：
內(nèi)毒素是影響轉染效率高低的因素之一，請務必使用無內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得高純度的DNA，紫外可見光光度法測濃度并標記計算用量。（質(zhì)粒純度：A260/A280 比值 (1.7-1.9)，越近 1.8 越好）
(三)轉染復合物制備：
血清會影響復合物的形成從而影響轉染效率，用無血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM)稀釋DNA和轉染試劑。DNA和Lipo2000的比例，絕大多數(shù)細胞系通常推薦1:2-1:3，建議比例見下表。
表：轉染試劑Lipofectamine2000與質(zhì)粒的用量參照表
對于每個轉染樣品（以六孔板為例），按如下方步驟制備轉染復合物:
1) Lipo2000稀釋液：取合適的EP管加入1500μl（250μl/孔） Opti-MEM，加入60μl（10μl/孔）Lipo2000混勻，室溫下靜置5分鐘。
2) DNA稀釋液：根據(jù)DNA的種類不同，分別于EP管中加入250μl/孔Opti-MEM，再加入4μg/孔質(zhì)粒DNA輕輕混勻。
3) 將1)Lipo2000稀釋液以250μl/孔加入到2)各DNA稀釋液中，輕柔混勻，室溫靜置30min，形成DNA-Lipo2000復合物。
(四)轉染操作：
細胞在轉染前1小時左右更換新無雙抗無血清培養(yǎng)基。將制備好的DNA-Lipo2000復合物分別加入細胞培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)板輕輕搖動使復合物分布均勻。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，并在4-6h后更換wan全培養(yǎng)基。
(五)觀察：
如果轉染的是帶有熒光標簽的質(zhì)粒，可以在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。
(六)注意事項：
1)Lipo2000脂質(zhì)體轉染試劑4℃保存，不可凍存。
2) Lipo2000脂質(zhì)體轉染試劑避免長時間暴露在空氣中導致脂質(zhì)體氧化而影響轉染效率。
3)有些無血清培養(yǎng)基(比如DMEM,CD293,SFMII,V-SFM等)稀釋DNA和轉染試劑時轉染效率有可能會降低。
4)Lipo2000脂質(zhì)體轉染試劑不能渦旋、離心、暴力吹打，緩慢晃動混勻即可。
5)用量僅供參考，具體用量請根據(jù)細胞類型、鋪板密度等其他實驗條件進行優(yōu)化。
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