志賀氏菌屬通用探針法 qPCR 試劑盒使用說明
志賀氏菌屬（Shigella spp.）通稱痢疾桿菌，革蘭染色陰性，是人類細菌性痢疾的病原菌，以病人和帶菌者為傳染源。志賀菌是重要的腸道病原菌，每年導致quan世界一百多萬人死亡。據調查，志賀菌在我國內陸地區廣泛分布是各地衛生部門要重點檢測的致病菌。因此快速靈敏診斷志賀菌屬具有重要意義，因此快速檢測志賀氏菌屬具有重要的意義。本產品就是以探針法 qPCR 技術為基礎開發的專門檢測志賀氏菌屬的試劑盒，它具有下列特點：
產品及特點
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到 100 拷貝/反應。
3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據志賀氏菌屬 DNA 高度保守區設計，不會跟其他生物的DNA 發生交叉反應。
5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5個數量級。
6.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
7.本產品只能用于科研。
規格及成分
本產品采用五孔盒包裝
成分
| 編號
| 規格
| 包裝
|
2×Probe qPCR MasterMix
| 981201
| 0.5 mL
| 0.5mL 本色蓋
|
熒光 PCR 模板專用稀釋液
| 180701
| 1 mL
| 1.5mL 綠蓋管
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超純水
| 210806
| 1 mL
| 1.5mL 藍蓋管
|
志賀氏菌屬 qPCR引物-探針干粉
| yp15-40000-ldd
| 50 次
| 1.5mL 棕色管
|
志賀氏菌屬 qPCR 陽性對照(1×10E7 拷貝/μL)
| pc60908-40000
| 50 μL
| 0.5mL 黃蓋管
|
使用手冊
| 15-40000sc
| 1 份
| 無
|
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入 162uL 的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。
自備試劑
樣品 DNA。
使用方法
一、稀釋標準曲線樣品
（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分
| 樣品管N+2 個
| PCR 陰性對照
| 標準曲線樣品管（1-6 管）
|
2×Probe qPCR MasterMix
| 各 10 μL
| 10 μL
| 各 10 μL
|
志賀氏菌屬 qPCR引物-探針混合液
| 各 3 μL
| 3 μL
| 各 3 μL
|
N+2 個待測 DNA 樣本
| 各 7 μL
| 不加
| 不加
|
超純水
| 不加
| 7 μL
| 不加
|
第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6 號） | 不加
| 不加
| 各 7μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）
|
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：
過程
| 溫度
| 時間
|
預變性
| 95℃
| 5 min
|
PCR 反應 （45 個循環）
| 95℃
| 15 sec
|
60℃
| 40 sec（采集 FAM 通道的熒光信號，淬滅基團為 MGB）
|
四、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct或 Ct 大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于 40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct 或 Ct 大于或等于 40，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性。
