引言
2023 年，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 因在 mRNA 核苷堿基修飾方面重要的基礎性發現而榮獲諾貝爾生理學或醫學獎，這一發現使得開發出針對 COVID-19 的有效 mRNA 疫苗成為了可能[1]。在 mRNA 體外轉錄 (In Vitro Transcription, IVT) 時摻入修飾的核苷, 如假尿苷 (Ψ)、N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 等, 可以降低其免疫原性、增強穩定性并提高產出。IVT mRNA 的核苷修飾已有廣泛研究, 如核苷修飾的 COVID-19 mRNA 疫苗在較早之前已得到緊急使用授權[2]。近期，核苷修飾在 mRNA 體外轉錄工藝流程中的安全性和有效性引發了行業內外的高度關注。
理論基礎
2005 年，Katalin Karikó 等人首次發現將假尿苷 (Ψ) 引入 RNA 中能降低其免疫原性，并且 RNA 的免疫原性隨著假尿苷 (Ψ) 引入比例的增高而降低[3]。2008 年，Katalin Karikó 等人再次發現用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 的 mRNA 不僅能極大地降低 mRNA 的免疫原性，還能提高 mRNA 的穩定性并增強其翻譯能力[4]。2010 年，Anderson 等人進一步探究假尿苷 (Ψ) 增強 mRNA 翻譯能力的原因，結果顯示，含有尿苷的 mRNA 體外轉錄會激活 RNA 依賴性蛋白激酶 (PKR)，隨后磷酸化翻譯起始因子 (eIF-2α)并抑制翻譯，而含有假尿苷的 mRNA 在體外轉錄過程中較少的激活 PKR，其翻譯不會受到抑制[5]。
圖 1 mRNA 體外轉錄 (IVT) 流程圖[6]
前沿動態
2015 年，Oliwia Andries 等人證實用 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 完全替代尿苷 (U) 比用假尿苷 (Ψ) 完全替代尿苷 (U) 更能降低 mRNA 的免疫原性，且更能增強 mRNA 的蛋白表達能力[7]。2021 年，Pedro Morais 等人通過公開數據，對比了科威瓦克 (CureVac) 、輝瑞-拜恩泰科 (Pfizer-BioNTech) 和莫德納 (Moderna) 三家公司生產的 mRNA 疫苗有效性的差異，深入探討了 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 對 COVID-19 mRNA 疫苗的關鍵性貢獻[8]。2023 年，Thomas E. Mulroney 等人研究發現 N1-甲基假尿苷 (m1Ψ) 摻入 mRNA 能夠誘導在核糖體滑動序列處發生+1核糖體移碼，并通過設計一系列實驗來證明 N1-甲基假尿苷誘導發生 +1 核糖體移碼的作用機理及減少移碼的可行方法[9]。
圖 2 從尿苷 (U) 到假尿苷 (Ψ) 異構化及進一步甲基化的示意圖[8]
目前，通過測定起始物料和反應底物中核苷 (Nucleosides) 及核苷三磷酸 (NTPs) 的含量，可以用來判定反應進行的程度，全程監控 mRNA 體外轉錄反應的過程，也可以用于優化起始物料的配比，為后續工藝改進提供思路。例如，使用低穩態水平的 UTP，可以減少體外轉錄過程中 dsRNA 副產物的形成[10]；采用陰離子交換 HPLC 監測 mRNA 體外轉錄反應，支持 mRNA 生產工藝開發[11]。
賽默飛應用解決方案
01 Acclaim C30 應用于尿苷、假尿苷和 N1-甲基假尿苷的分離
1.1 儀器配置及色譜條件
液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統，配置：泵 Quaternary Pump C，自動進樣器 Split Sampler CT，柱溫箱 Column Compartment C，檢測器 Diode Array Detector C，數據處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)
流動相、流速及洗脫程序：詳見應用解決方案
進樣量：5 μL；樣品盤溫度：15 ℃
柱溫：40 ℃
采集波長：260 nm；采集頻率：10 Hz；
光譜采集：190-400 nm
1.2 分離譜圖及數據
02 Acclaim C30 應用于 N1-甲基假尿苷及其含磷衍生物的分離
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2.1 儀器配置及色譜條件
液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統，配置：泵 Quaternary Pump C，自動進樣器 Split Sampler CT，柱溫箱 Column Compartment C，檢測器 Diode Array Detector C，數據處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm (P/N: 078664)
流動相、流速及洗脫程序：詳見應用解決方案
進樣量：2 μL；樣品盤溫度：15 ℃
柱溫：15 ℃
采集波長：260 nm；采集頻率：10 Hz；
光譜采集：190-400 nm
2.2分離譜圖及數據
03 關于 Acclaim C30 色譜柱[12]
3.1 Acclaim C30 可耐受 100% 水相，耐受 pH 范圍為 2-8，耐受溫度上限為 60 ℃
3.2 Acclaim C30, 3 μm, 2.1×250 mm 耐受壓力上限為 10000 psi，推薦流速 0.2–0.3 mL/min
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參考文獻
[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2023. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/summary/
[2] 侯書婷, 于傳飛, 王蘭, 王軍志. 體外轉錄mRNA藥物的技術進展和應用前景[J]. 藥學學報, 2023, 58(8): 2047-2058. DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0201
[3] Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H. and Weissman, D. Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165–175 (2005).
[4] Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S. and Weissman, D. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther 16, 1833–1840 (2008).
[5] Anderson, B.R., Muramatsu, H., Nallagatla, S.R., Bevilacqua, P.C., Sansing, L.H., Weissman, D. and Karikó, K. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 38, 5884–5892 (2010).
[6] Overview of In Vitro Transcription. https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/industrial/pharma-biopharma/nucleic-acid-therapeutic-development-solutions/mrna-research/overview-in-vitro-transcription.html
[7] Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, Weiss R, Sanders NN, Kitada T. N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J Control Release. 2015 Nov 10;217:337-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.08.051. Epub 2015 Sep 3. PMID: 26342664.
[8] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4; 9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071.
[9] Mulroney, T.E., Pöyry, T., Yam-Puc, J.C. et al. N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting. Nature 625, 189–194 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06800-3
[10] Ziegenhals T, Frieling R, Wolf P, Göbel K, Koch S, Lohmann M, Baiersdörfer M, Fesser S, Sahin U, Kuhn AN. Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP. Front Mol Biosci. 2023 Dec 11;10:1291045. doi: 10.3389/fmolb.2023.1291045.
[11] Welbourne EN, Loveday KA, Nair A, Nourafkan E, Qu J, Cook K, Kis Z, Dickman MJ. Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development. Front Mol Biosci. 2024 Mar 7;11:1250833. doi: 10.3389/fmolb.2024.1250833. PMID: 38516194; PMCID: PMC10955092.
[12] Acclaim C30 column - Thermo ScientificTM AcclaimTM C30 columns provide unique selectivity and superior separations of hydrophobic, structurally related analytes.
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