運用Pure系統
快速純化各種范圍的多肽
Pure應用
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簡介
肽序列的新發現為現代醫學提供了新的藥物開發候選。天然產物和合成肽的純化過程是藥物開發過程中的重要步驟，通常使用制備型 HPLC 來完成，這可能既昂貴又耗時。Flash 快速制備色譜是純化合成肽和其他小分子藥物的快速且經濟高效的方法。使用 Flash 快速制備色譜可以快速增加肽的總體純度，然后再添加下一個氨基酸或在制備型 HPLC 上進行最終精制。
這項工作證明了使用具有 ELSD 和 UV 檢測功能的 Pure 色譜系統可以純化和回收多種肽。與制備型 HPLC 色譜柱相比，FlashPure C18 柱顯示出高負載能力和高分離度的肽純化能力，單次進樣可處理更多量的肽。并且與制備型 HPLC 相比，Flash 快速制備色譜減少了純化時間和溶劑使用量。
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實驗
通過這項工作，我們開始測試Flash快速制備色譜是否對純化多種肽有任何優勢。所以，我們選擇肽樣品的大小范圍從幾個氨基酸到長度為32個氨基酸。為了測試裝載能力的優勢，我們在 12g FlashPure C18、60?， 40μm 柱子中裝載了 30mg–1g 多肽抗生素（多粘菌素B硫酸鹽）。
接下來，我們測試了 Pure 快速純化的能力，以充分混合在分離肽和小氨基酸（?；撬幔?5mg）+萬古霉素（45mg）+多粘菌素（56mg）。
樣品：
多肽，氨基酸和多肽抗生素（Sigma Aldrich）
合成肽混合物（California Peptide Research, Inc）
設備：
Pure 分離純化系統（BUCHI）
耗材：
Flash Pure C18（BUCHI）
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結果與討論
評估60?，40μm C18色譜柱的載樣能力
為了測試載樣能力，將 30mg–1g 的多粘菌素B硫酸鹽裝入12g FlashPure C18 中，通常來講 HPLC 的典型制備上樣量為柱子填料量的 0.1- 1.0％。而快速純化載樣數據表明，可加載 0.1–10％ 的樣品而不會對色譜柱產生不利影響。這意味著與通常需要多次進樣的單獨制備型HPLC相比，使用快速純化可以在一次進樣中處理更大量的粗肽。與此同時，可以使用更少的溶劑和更少的時間來純化大量的樣品。Pure 純化系統的另一個優勢是能夠使用干法上樣方式為低溶解度樣品提供更高的負載量。
▲ Polymyxin B 的快速純化載樣數據表明，上樣量可達分離柱質量的 0.1–10％，而對回收率沒有不利影響。
評估多肽混合物的分離
包含兩個多肽（萬古霉素和硫酸多粘菌素B）和一個小氨基酸（牛磺酸）的測試混合物證明了 Pure 快速純化系統能夠充分分離肽混合物的能力。結果表明，使用 60?，40μm C18 介質進行快速純化可充分分離出三種具有對稱峰形的化合物。UHPLC證實了萬古霉素和硫酸多粘菌素B的純度均高于 98％?；旌衔镌?0分鐘內純化，這比使用制備型 HPLC 純化相同混合物快約4倍。除此之外，結合了 UV 和 ELSD 雙檢測器系統的另一個好處是，可以檢測和收集未反應的氨基酸片段和無紫外吸收產物。以此為例，?；撬醿H被 ELSD 檢測到。
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結論
結果表明，Pure 系統與反相 C18 色譜柱的結合使用可成功用于純化多種從單個氨基酸到大肽的肽段（接近5000 MW）。根據圖譜顯示，Pure 分離純化系統可以單獨使用，也可以在制備型 HPLC 之前用作預純化步驟，這可以提高肽段純化過程的效率。數據表明，樣品的上樣量可達到快速色譜柱填料量的 10％，并使用快速色譜法成功純化。這意味著，與通常需要多次進樣的單獨制備型 HPLC 相比，使用快速純化在一次進樣中可以在更短的時間內處理大量的粗肽。自動快速色譜的另一個好處是能夠使用干法上樣的進樣技術為低溶解度的樣品提供更高的負載量。將 UV 和蒸發光散射檢測（ELSD）結合使用的另一個優點是，可以檢測和收集未反應的氨基酸片段和無紫外吸收的產物。
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