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生物分子類實驗室常用實驗技術原理匯總-9
閱讀：639 發布時間：2014-12-11二十六、雙向凝膠電泳（2-DE）
雙向凝膠電泳的原理是*向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。
二十七、mRNA的分離與純化（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）
真核細胞的mRNA分子zui顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
二十八、His-tag純化蛋白
His•Tag序列（6、8或10個連續的組氨酸殘基）與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His•Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結合。洗去未結合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標蛋白。該通用系統使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。
二十九、RNA酶保護試驗方法 (RNase Protection Assay，RPA)
RNA酶保護法是近十年發展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結合，形成雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點：1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2. 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4.步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。5. RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6. 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7. 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。
三十、免疫組化
三十一、各種分子標記技術的比較
限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標記,開創了直接應用DNA 多態性的新階段,是zui早應用的分子標記技術 。RFLP 是檢測DNA 在限制性內切酶酶切后形成的特定片段DNA的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA序列上的微小變化,甚至1 個核苷酸的變化,也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生, 導致酶切片段長度的變化。
隨機擴增多態DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術,由于其*的檢測DNA多態性的方式使得RAPD 技術很快滲透于基因研究的各個領域。RAPD 是建立于PCR 基礎之上的分子標記技術,基本原理是利用一個隨機引物(8～10 個堿基) 通過PCR 反應非定點地擴增片段DNA,然后用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA多態性研究。對任一特定引物而言,它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點,一旦基因組在這些區域發生片段DNA插入、缺失或堿基突變,就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化,從而導致擴增產物的數量和大小發生改變,表現出多態性。
擴增片段長度多態技術(AFLP) ,又名限制片段選擇擴增技術(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發明。AFLP 是近年來迅速發展起來的一種分子標記技術,它將基因組DNA用成對的限制性內切酶雙酶切后產生的片段用接頭(與酶切位點互補) 連接起來,并通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量片段DNA,從而形成指紋圖譜的分子標記技術。AFLP 指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。
SSR 也稱微衛星DNA ,是一類由幾個(多為2～6個) 堿基組成的基序串聯重復而成的DNA 序列,其中zui常見的是雙核苷酸重復,即(CA) n和(TG) n ,每個微衛星DNA 的核心序列結構相同,重復單位數目10～60 個,其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。不同遺傳材料重復次數不同,導致了SSR 長度的高度變異性,這一變異性正是SSR 標記產生的基礎。
單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA分子標記,是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異,這種差異包括單個堿基的缺失或插入 ,更常見的是單個核苷酸的替換,且常發生在嘌呤堿基(A 與G) 和嘧啶堿基(C 與T) 之間。SNP 標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異,被認為是應用前景的遺傳標記。