凋亡如何測？流式圖看不懂？簡簡單單教你讀懂凋亡流式圖！！！！做個流式小能手~~
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什么是凋亡？
細胞凋亡 (Apoptosis)，或者說是程序性細胞死亡，是細胞遵循自身基因指令進行的一種有條不紊的自我毀滅過程。這個過程在生物體的正常發育和維持健康狀態中扮演著重要角色，并且在一些疾病狀態下也會發生[1]。
細胞凋亡會產生什么樣的變化呢？
早期階段，你會看到細胞開始皺縮變小，細胞核會破裂成碎片，同時細胞表面會出現一些泡泡狀的小突起，最終這些突起會分離出來，形成含有細胞內部物質的小包，我們稱之為“凋亡小體"。有趣的是，盡管細胞正在分解，但它的外層膜仍然保持完整，確保了細胞內容物不會隨意泄漏出去。
圖 1. 細胞凋亡過程。
除此之外，細胞內部還會發生一系列化學反應，例如激活特定的酶 (Caspase)，這些酶會進一步切割其他蛋白質，像 PARP 這樣的底物。還有，線粒體中的細胞色素 c 會被釋放到細胞質中，DNA 會被切割成小片段。細胞膜也會發生變化，比如位于膜內側的磷脂酰絲氨酸 (PS) 會翻轉到外側，同時線粒體膜電位也會改變。最后，調控細胞生死命運的蛋白家族成員，如 Bax、Bid、Bcl-2 等，它們的表達量也會有所調整，以促進或抑制細胞凋亡的過程[1][2][3]。
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如何檢測凋亡呢？
那怎么檢測細胞凋亡呢？我們在這介紹了兩種流式檢測方法，如果你感興趣的話讓我們一起看下去吧~
首先，最-常用的細胞凋亡檢測方法是 Annexin V/PI 雙染法。
Annexin V 是一種依賴鈣離子的蛋白質，能特異性地綁定到細胞膜上的磷脂酰絲氨酸 (PS)。在健康細胞中，PS 位于細胞膜內側；而在凋亡早期，PS 會移到外側。因此，用熒光標記 (如 FITC) 的 Annexin V 可以檢測到這個變化，表明細胞開始凋亡。
PI (碘化丙啶) 是一種紅色熒光染料，它不能進入活細胞或早期凋亡細胞，但可以進入已經死亡或晚期凋亡細胞，因為這些細胞的膜已經破損。
所以，通過 Annexin V 和 PI 的結合使用，我們可以區分早期凋亡、晚期凋亡和壞死的細胞。這種方法可以通過流式細胞儀或熒光顯微鏡輕松完成檢測。
其次，我們還可以檢測線粒體跨膜電位 (?ΨM)，在具有較高 ?ΨM 的健康細胞中，JC-1 染料可進入細胞并在線粒體中積累，形成 J-aggregates 發出橙紅色熒光。在凋亡細胞中，?ΨM 較低，JC-1 染料進入線粒體較少，以單體形式存在發出綠色熒光。
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案例: Annexin V/PI 法檢測
接下來，讓我們一起來看看 Annexin V/PI 法檢測實戰吧！
案例一
為了探究敲低 MUC16 對鼻咽癌細胞系 C666-1 和 HK-1 的糖酵解以及免疫逃逸能力的影響，作者利用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒 (HY-K1073) 評估了鼻咽癌細胞在不同處理條件下的凋亡情況[4]。
圖 2. 流式細胞術顯示 C666-1 和 HK-1 細胞中 MUC-16 的缺失誘導了細胞凋亡[4]。
a. 活細胞中，不可檢測到 Annexin V-FITC/PI 的熒光。因為活細胞的細胞膜完整，不結合 Annexin V-FITC，PI 也無法穿過細胞膜進入細胞，不發光。
b. 早期凋亡細胞中，可以檢測到 Annexin V-FITC 的熒光，但不可檢測到 PI 的熒光。因為細胞膜磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻，Annexin V 可以結合，但細胞膜完整，PI 無法穿過細胞膜進入細胞，顯示出綠色熒光。
c. 晚期凋亡細胞中，均可以檢測到 Annexin V-FITC/PI 的熒光。因為細胞膜的完整性被破壞，Annexin V-FITC/PI 都可以進入細胞，顯示出綠色和紅色熒光。
d. 流式圖的縱坐標是 PI，在左上 (Q1-UL) 區域，發出紅色熒光，紅色熒光越強，表示細胞死亡越嚴重。流式圖的橫坐標是 Annexin V-FITC，在右下 (Q1-LR) 區域發出綠色熒光，綠色熒光越強，表示早期凋亡細胞越多。左下 (Q1-LL) 是正常細胞，不發光。右上 (Q1-UR) 是晚期凋亡細胞和壞死細胞，發出綠色和紅色兩種熒光。
案例二
為了評估不同濃度的 1,25(OH)2D3 對頭腎巨噬細胞 (HKMs) 細胞活力的影響，作者利用 Annexin V-iFluor 488/PI (HY-K1080) 檢測細胞凋亡[5]。
圖 3. 流式細胞術檢測 1,25-(OH)2D3 對 HKMs 細胞凋亡的影響[5]。
a. 1,25(OH)2D3 未處理組活細胞百分比為 24.8%。
b. 1 nM 處理組肝細胞百分比為 36.1%。
c. 10 nM 處理組活細胞百分比為 56.3%。
d. 100 nM 處理組活細胞百分比為 40.8%。
e. 流式圖的橫坐標是 FL1-H (FITC-H) 代表 Annexin V-iFluor 488 的熒光強度。Annexin V-iFluor 488 用于檢測早期凋亡細胞。流式圖縱坐標是 SSC-H (SSC-H) 代表側向散射光強度，用于檢測細胞的顆粒性和細胞內結構的復雜性，側向散射光強度通常與細胞內顆粒物的大小和數量有關。
f. 低側向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 熒光強度 (FL1-H)。通常代表活細胞。高側向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 熒光強度 (FL1-H)。通常代表細胞凋亡晚期或壞死細胞。高側向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 熒光強度 (FL1-H)。通常代表細胞凋亡早期。低側向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 熒光強度 (FL1-H)。通常代表細胞凋亡早期。
Annexin V/PI 法檢測實驗步驟和注意事項
(以 HY-K1073 為例)
1． 細胞與 Annexin V-FITC 和 PI 孵育
1.1 收集細胞：收集 1-5 × 105 個細胞。
懸浮細胞：1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預冷的 PBS 輕輕重懸細胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細胞沉淀。
貼壁細胞：小心吸取細胞培養液保存備用。加入 PBS 洗滌后，加入適量胰酶消化液 (盡量不含 EDTA，以免影響 Annexin V 和 PS 的結合) 消化細胞。加入前面收集的培養液，輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液，1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預冷的 PBS 輕輕重懸細胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細胞沉淀。注：建議胰酶消化液不含 EDTA。
2. 加入 195 μL Binding Buffer，輕輕重懸細胞。
3. 加入 5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。
4. 加入 10 μL PI Stain，輕輕混勻。
5. 室溫下避光孵育 10-20 min。
注：孵育過程中可輕輕顛倒數次以加強染色效果。
6. 流式細胞儀檢測：用流式細胞儀檢測熒光強度。
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注意事項
a. 流式檢測時，Annexin V-FITC 最大激發波長為 488 nm，最大發射波長為 525 nm，在 FL1 通道檢測；PI-DNA 最大激發波長為 535 nm，最大發射波長為 617 nm，在 FL2 或FL3 通道檢測。
b. 建議設置三組對照：未染色組、PI 單染組及 Annexin V-FITC 單染組。
c. 所有操作應盡量快速，避免細胞長時間暴露于非生理條件下。
d. 染色后的樣本需盡快分析，以防止染料信號減弱影響結果準確性。
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案例:
JC-1 法檢測線粒體跨膜電位
那么 JC-1 法檢測線粒體跨膜電位是怎么做的呢？一個案例帶你讀懂 JC-1 法！
文獻中為了檢測人參皂苷 Rd 在高糖條件下對細胞狀態的影響，利用 JC-1 (HY-15534) 檢測線粒體膜電位變化[6]。
圖 4. 流式細胞術顯示人參皂苷 Rd 和 NAC 對高糖誘導的線粒體功能障礙具有保護作用[6]。
a. 高糖處理 (HG) 導致線粒體膜電位下降，表現為綠色熒光增加。
b. 人參皂苷 Rd 和 NAC 均能部分或完-全恢復高糖處理導致的線粒體膜電位下降，表現為綠色熒光減少，紅色熒光增加。
c. 人參皂苷 Rd 的效果隨著濃度的增加而增強。
實驗步驟與注意事項
一、JC-1 染色液的配制
制備儲存液
用 DMSO 配制 5 mg/mL 的 JC-1。如用 1 mL DMSO 溶解 5 mg JC-1。
注意：1) JC-1 儲存液建議分裝后于 -20℃ 或 -80℃ 避光保存。
工作液的配制
用預熱好的無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-20 μg/mL 的 JC-1 工作。
注意：
1) 請根據實際情況調整 JC-1 工作液濃度，且現用現配。
2) 如果 JC-1 進入細胞的效果不好，可向工作也液中加入適量 20% Pluronic F127 溶液，終濃度為 0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 JC-1 在緩沖液中聚合并幫助其進入細胞。
二、JC-1 染色
1. 以 6 孔板為例進行細胞鋪板，密度為 5×105 cells/mL。37℃，5% CO2 培養箱培養過夜。
注意：進行凋亡誘導時的細胞密度建議不超過 1×106/mL，也可根據自己的細胞類型培養至合適的密度。
2. 取 0.5 mL 細胞懸液至無菌的離心管內。
3. 400 g 離心 3-5 min；棄上清。
4. 用 1 mL JC-1 工作液重懸細胞，于 37℃，5% CO2 培養箱孵育 15-30 min。
5. 室溫條件 400 g 離心 5 min；吸掉上清。
6. 用 2 mL 細胞培養液或者緩沖液重懸細胞，之后室溫條件 400 g 離心 5 min；棄上清，重復兩次。
7. 用 1 mL 新鮮培養液或者緩沖液重懸細胞，立刻進行后續的流式分析或熒光顯微鏡觀察。
8. 數據分析 (流式細胞儀)：含有紅色 JC-1 聚集物的健康細胞線粒體用 FL2 通道檢測；含有綠色 JC-1 單體的凋亡或不健康細胞用 FL1 (FITC) 通道檢測。
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小結
用流式細胞術檢測細胞凋亡，你學會了嗎？如果你覺得這篇干貨滿滿的凋亡檢測方法有幫助，記得動動小手點贊收藏哦！！！我們下期見，為大家帶來更多的科研小干貨~
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[1] Susan Elmore, et al. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007 Jun;35(4):495-516.
[2] Rebecca C Taylor, et al. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Mar;9(3):231-41.
[3] Anna Chmurska, et al. Two Faces of Autophagy in the Struggle against Cancer. Int J Mol Sci. 2021 Mar 15;22(6):2981.
[4] Yueyang Liu, et al. Hypomethylation-associated ELF3 helps nasopharyngeal carcinoma to escape immune surveillance via MUC16-mediated glycolytic metabolic reprogramming. Am J Physiol Cell Physiol. 2024 Sep 2;327(4):C1125–C1142.
[5] Fengxia Zhao, et al. Oral administration of high-dose vitamin D3 can effectively suppress Nocardia seriolae infection in largemouth bass (Micropterus salmoides). Aquaculture. Volume 595, Part 2, 30 January 2025, 741643.
[6] Kai Tang, et al. Ginsenoside Rd ameliorates high glucose-induced retinal endothelial injury through AMPK-STRT1 interdependence. Pharmacol Res. 2022 May:179:106123.
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