在以往推文中，我們詳細介紹了 PCR 實驗的基礎與進階技巧，解答了許多實驗中常見的問題及解決方案。今天，我們將深入探索 qPCR 的兩位“隱形英雄"：熔解曲線和 Ct 值。它們看似“低調"，卻往往是分析實驗結果的關鍵因素。讓我們一同揭開它們的的神秘面紗，聊聊 qPCR 的那些事兒！
實時熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 可實時監測 DNA 擴增過程中的熒光信號，以實現對起始模板的定量分析。通過在 PCR 反應體系中引入熒光探針或染料，使得每個擴增循環中產生的熒光信號可以被實時檢測，從而反映出擴增產物的量[1]。
簡單來說，它就像 DNA 擴增界的“股-票走勢分析師"，實時告訴你擴增了多少，何時到達“拐點" (Ct 值)。
圖 1. qPCR 流程圖[1]。
SYBR Green 和 TaqMan 是實時熒光定量 PCR (qPCR) 中兩種常用的檢測探針，各自具有不同的優缺點。以下是這兩種方法的對比：
• 擴增曲線 (Amplification Curve)：評估反應效率的重要工具，確保實驗結果的科學性和可靠性。
• Ct 值 (Cycle Threshold)：反應樣品中靶標 DNA 的初始量，Ct 值越小，說明樣品中靶標 DNA 的初始量越多。
• 熔解曲線 (Melting Curve)：驗證特異性的小助手，判斷是否有非特異擴增或引物二聚體。
擴增曲線 (Amplification curve) 是指隨 PCR 反應進行，根據熒光信號強度隨著循環數變化而繪制的曲線。
圖 2. qPCR 擴增曲線示意圖。
正常的擴增曲線 (S 型) 包括四大“黃金階段"：基線期、指數增長期、線性增長期、平臺期。
• 基線期：“熱身階段"，通常出現在反應的前 3 - 15 個循環內。這一階段儀器會聰明地根據這段“無聲無息"的信號計算出基線范圍，為后續的“精彩瞬間"埋下伏筆。
• 指數增長期：PCR 反應的“高潮時刻"，是擴增曲線快速上升的階段。所有試劑都“活躍"了，DNA 聚合酶就像賽車手，快速合成，反應也達到了最佳效率——這就是“指數"的威力！這一階段是做定量分析的最佳時期，PCR 產物量和初始模板量質檢幾乎可以畫出一條完-美的直線。
• 線性增長期：PCR 反應進入“疲軟期"。隨著原料逐漸耗盡，DNA 聚合酶開始“累了"，反應效率逐漸降低，熒光信號的增長速度慢慢放緩，產物量和初始模板量之間的指數關系開始變得不那么“準確"。
• 平臺期：PCR 反應到達“終點站"，這一階段熒光信號基本停滯不前，趨于平穩，擴增就此“畫上句號"。不同反應進入平臺期的時間和信號高低不同，反應的“完結"也各有差異。
擴增曲線分析:
你的擴增曲線是“黃金路線"還是“問題頻發"
Ct 值，全稱為 Cycle Threshold，即在 PCR 反應中，每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。
簡單來說，Ct 值指在 PCR 反應中的熒光信號突破了“背景噪音"，開始呈指數級上升時，對應的那個“拐點"所處的循環次數，它告訴我們“什么時候開始有戲了"。總結一句話，Ct 值就像是 PCR 實驗中的“開場白"，它告訴你“什么時候開始精彩"！
Ct 值和起始模板量之間的關系就像參加跑步比賽，起跑線距離終點的遠近決定了跨越終點的時間。簡單來說，起始模板量越多，PCR 反應越快，Ct 值就越??；而起始模板量越少，反應就會慢一些，Ct 值自然就會更大。
通過逐步提高溫度同時監測每個溫度點的熒光信號變化，最終生成一條“熔解曲線" (Melting Curve)。隨著溫度上升，DNA 雙鏈結構開始解開，熒光信號從雙鏈中釋放出來，熒光信號下降，最終升高到 DNA 雙鏈解開 50% 的溫度即為溶解溫度 (Tm)，是 DNA 解鎖的關鍵溫度。
熔解曲線聽起來像是 DNA 在做一場高溫的“脫單"大典！它揭示了隨著溫度升高，DNA 雙螺旋結構逐漸分開變成“單鏈情人"的過程，用于分析 PCR 產物的濃度、特點及純度。
圖 3. qPCR 熔解曲線示意圖。
熔解曲線分析:
你的熔解曲線是“好演員"還是“草臺班子"?
qPCR 實驗中，Ct 值幫你量化基因表達，熔解曲線幫你驗證特異性。強強聯合堪稱 qPCR 實驗成功的“黃金搭檔"。所以，下次當你看到漂亮的 Ct 值和干凈的熔解曲線時，不妨給自己點個贊！
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[1] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.
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