細胞線粒體分離試劑盒
MCE 國際站：Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20oC 保存一年。
簡介：MCE 細胞線粒體分離試劑盒可快速分離所培養細胞的線粒體，且線粒體純度較高，絕大多數具有完整的內外膜及生理功能。
概述：線粒體是真核細胞中產生能量的主要部位，具有雙層膜結構。制備線粒體的關鍵在于確保線粒體的完整性和純度。通常先低速離心去除細胞核及細胞碎片，再高速離心獲得線粒體。MCE 細胞線粒體分離試劑盒可快速分離所培養細胞的線粒體，且線粒體純度較高，絕大多數具有完整的內外膜及生理功能。提取的線粒體也可被相應裂解液裂解后得到線粒體蛋白，用于 SDS-PAGE、WB、雙向電泳等蛋白分析。此外，本試劑盒也可用于提取不含線粒體的細胞漿蛋白。本試劑盒可檢測50-100 個樣品，建議每個樣品的細胞數量為 2-5×107 個。
描述：
線粒體是真核細胞中大部分能量產生的場所，具有雙層膜結構：外膜和折疊的內膜。線粒體的制備關鍵是確保線粒體的完整性和純度。
MCE培養細胞線粒體分離試劑盒采用差速離心法，可快速高效地從細胞中分離線粒體。分離出的線粒體大部分具有完整的內外膜，并具有生理功能。此外，該試劑盒還可用于提取線粒體蛋白和不含線粒體的胞質蛋白。該試劑盒含有足夠的試劑，可從2-5×107個細胞中進行50-100次分離程序。
操作說明：1. 從 -20oC 冰箱中取出各試劑，室溫解凍，置于冰上備用。2. 將 1.5 mL PMSF (solvent) 加入 PMSF (crystal) 中，充分溶解，即得 1.5 mL 100 mM PMSF 溶液3. 提前接種細胞，至細胞密度達到 70-90%。4. 收集細胞貼壁細胞：棄去細胞培養液，加入 PBS 洗滌一次。加入 Trypsin Buffer 消化細胞，100-200 g，4oC 離心 5-10 分鐘懸浮細胞：100-200 g，4oC 離心 5-10 分鐘收集細胞注：Trypsin Buffer 本試劑盒未提供，需另行購買。5. 加入預冷的 PBS 重懸細胞，600 g，4oC 離心 5 分鐘，棄去上清。6. 每 2-5×107 個細胞中加入 1-2.5 mL Mitochondria Isolation Reagent(含 1 mM PMSF)，輕輕重懸細胞，冰浴 10-15 分鐘。7. 將細胞懸液轉移至勻漿器中，勻漿 10-30 下。注：a. 需根據細胞類型及勻漿器類型自行優化勻漿次數。b. 可在勻漿 10 次后取 2 μL 細胞勻漿，加入 30-50 μL Trypan Blue 染色鑒定勻漿效果。若陽性細胞（藍色）比例不足 80%，增加 5 次勻漿并用 Trypan Blue 染色鑒定，直至陽性比例超過 80%。c. 請勿過度勻漿，防止線粒體損傷。8. 將細胞勻漿 600 g，4oC 離心 10 分鐘。注：此步離心目的在于去除細胞核、細胞碎片及未裂解細胞。將離心速度提升至 1,000 g 可獲得更純的線粒體，但線粒體抽提率相對下降。9. 將上清轉移至干凈的離心管，11,000 g，4oC 離心 10 分鐘。注：此步離心目的在于沉淀線粒體。將離心速度改為 3,500 g 可獲得更純的線粒體，但線粒體抽提率相對下降。10. 棄去上清，所得沉淀即為細胞線粒體。注：此步驟也可用于獲得不含線粒體的細胞漿蛋白。收集本步驟中的上清，12,000 g，4oC 離心 10 分鐘，獲得的上清液即為不含線粒體的細胞漿蛋白。后續可用 BCA 法或 Bradford 法測定蛋白濃度。11. 線粒體的應用a. 完整線粒體的功能及酶活研究：每 2-5×107 個細胞分離得到的線粒體中加入 150-200 μL Mitochondria Storage Buffer，重懸備用。后續可使用 MCE 線粒體膜電位檢測試劑盒（Cat. No.: HY-K0601）測定分離得到的線粒體的膜電位。b. 線粒體蛋白分析：每 2-5×107個細胞分離得到的線粒體中加入 150-200 μL 臨用前添加了 PMSF 的 Mitochondria Lysis Buffer（PMSF 終濃度為 裂解后得到的線粒體蛋白經 12,000g，4oC，離心 3-5 min 后可用于 PAGE、WB、IP 及酶活測定，也可用 BCA 法或 Bradford 法測定蛋白濃度。
注意事項：1. 若要制備線粒體蛋白樣品，需在Mitochondria Isolation Reagent 和 Mitochondria Lysis Buffer 中加入 PMSF，且 PMSF 一定要在試劑加入樣品前1-2 min 內加入，防止 PMSF 失效。2. 整個實驗在冰上或 4oC 進行。所用溶液需冰浴或 4oC 預冷。3. 本實驗獲得的線粒體樣品若不能及時使用，建議 -80oC 保存。凍存后的線粒體不建議用于膜電位的檢測。4. Trypan Blue 和 PMSF 對人體有害，使用時務必小心。5. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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