WB（WesternBlot）是一種常用的生物化學(xué)實驗技術(shù)，用于檢測和分析蛋白樣品中特定蛋白質(zhì)的存在和表達(dá)水平。它通過將樣品中的蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到膜上，然后使用特定的抗體識別目標(biāo)蛋白，并通過化學(xué)或免疫檢測方法來可視化這些蛋白質(zhì)。WesternBlot技術(shù)通常包括樣品制備、SDS-PAGE電泳分離、蛋白轉(zhuǎn)印、封閉和抗體檢測、曝光顯影等步驟。目前WB被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中，用于研究蛋白質(zhì)表達(dá)、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)相互作用等。
圖1.WB流程圖
在日常實驗過程中，小分子蛋白是非常常見的，小分子蛋白是指待檢測的蛋白分子量小于20kda，常見的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關(guān)蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，這類蛋白由于較小的分子量，易受到凝膠網(wǎng)孔的影響在電泳過程中彌散，導(dǎo)致難以分離和檢測。因此，為了檢測到小分子量的蛋白，需要對實驗步驟進(jìn)行一些優(yōu)化，以提高實驗成功率。
1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對于小分子蛋白來說，分離膠濃度一般為12%-15%，對于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時在倒膠時濃縮膠的比例可以適當(dāng)增加到4：6，使其充分濃縮，后續(xù)電泳過程中一定程度上可以減少彌散。15-20kda可選擇12%的凝膠；10-15kda可選擇13.5%的凝膠；小于10kda的蛋白用15%的凝膠或者用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳體系。與傳統(tǒng)的Gly-SDS-PAGE相比，Tricine-SDS-PAGE使用三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），具有更好的小分子蛋白分離效果。
2. 上樣：根據(jù)日常上樣經(jīng)驗，建議在跑小分子蛋白時增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過多。選擇marker時，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續(xù)敷抗體時可以更清楚的進(jìn)行裁膜。電泳開始前可用1′loadingbuffer補齊未點樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。
圖1：賽默飛marker示意圖（左：常規(guī)蛋白marker；右：小分子蛋白marker）
3. 電泳：濃縮膠部分設(shè)置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線上之后調(diào)大電壓至110V，至所需蛋白區(qū)域全部分開為止。盡量避免長時間低電壓跑膠，易導(dǎo)致蛋白彌散過多。同時整個電泳過程中注意降溫。
4. 轉(zhuǎn)膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉(zhuǎn)膜時選擇0.22μm的PVDF膜，常規(guī)0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿足條件。
5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時根據(jù)marker上下留出足夠多的空間。
6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎(chǔ)上，一抗是出好結(jié)果的關(guān)鍵一步，若沒前期實驗經(jīng)驗，一抗的稀釋比一般按照說明書配置，若有前期實驗的經(jīng)驗，可適當(dāng)進(jìn)行比例調(diào)整，一抗?jié)舛冗^高最后顯影階段易出現(xiàn)雜帶，過低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜。
7. 后續(xù)二抗比例及孵育時間、顯影按常規(guī)操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結(jié)果，在敷完一二抗時可適當(dāng)延長洗膜時間及次數(shù)。
注意事項：
1. 轉(zhuǎn)膜時，若蛋白分子量過小，可適當(dāng)提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。
2. 跑小分子蛋白時marker盡量不跑到一張膜上，對于常見內(nèi)參GAPDH、Actin及Tubulin等來說，分離膠濃度大上述蛋白區(qū)域一般分不開或分離不完整，易導(dǎo)致內(nèi)參不齊。
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