細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命，最后裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬的過(guò)程，也稱為程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的方式，凋亡過(guò)程是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。那么你知道常見(jiàn)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
一、基于生物學(xué)功能的方法：
1.Annexin V/PI檢測(cè)磷脂酰絲氨酸 (PS)
在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜胞質(zhì)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V (膜聯(lián)蛋白V)是一種Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與外翻的PS特異性結(jié)合，因此Annexin V 常作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細(xì)胞膜的紅色核酸染料，可對(duì)凋亡晚期細(xì)胞及壞死細(xì)胞染色。
Annexin V 經(jīng)熒光素標(biāo)記后作為熒光探針，如Annexin V-FITC ，與PI聯(lián)合(凱基貨號(hào)：KGA107)染色后，正常細(xì)胞基本無(wú)熒光(Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光(Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光(Annexin V+/PI+)。借助流式細(xì)胞術(shù)即可檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。此外，除了用FITC標(biāo)記Annexin V 之外，也可以用EGFP、PE、APC、mCherry等作為熒光探針，也可以用7-AAD來(lái)替代PI作為核酸染料。
2.JC-1檢測(cè)線粒體膜電位凋亡早期細(xì)胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位(ΔΨm)下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的生物學(xué)變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。
二、基于生化標(biāo)記的方法：
1.TUNEL法檢測(cè)DNA片段原位
細(xì)胞凋亡形成的DNA斷裂會(huì)暴露DNA鏈的3’-OH末端，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)可催化斷裂DNA的3′-OH端的核酸聚合反應(yīng)，加入帶有熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標(biāo)記的dUTP，顯色反應(yīng)后可特異地進(jìn)行原位凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。正常或增殖細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，故很少被染色。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基貨號(hào)：KGA7072)適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細(xì)胞樣本(細(xì)胞涂片或爬片)的凋亡原位檢測(cè)。對(duì)于經(jīng)過(guò)固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過(guò)一步染色反應(yīng)，洗滌后就可以通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦等成像設(shè)備檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。
2.彗星電泳檢測(cè)DNA片段化
彗星電泳實(shí)驗(yàn)的原理：當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性因素誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。詳細(xì)操作和數(shù)據(jù)分析可參考干貨|彗星電泳法檢測(cè)DNA損傷-從實(shí)驗(yàn)到數(shù)據(jù)分析。
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