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液相色譜分析條件的選擇辦法

閱讀:1724        發布時間:2015-2-6

液相色譜分析過程中,我們經常遇到的問題主要有二種,一種與液相色譜儀器本身因素有關,如液相色譜的閥門、混合器、檢測器的光源以及其它的一些硬件設備。出現這類問題后,如果能找出問題根源,解決起來一般很簡單,而且這類問題可以通過對儀器的精心維護來避免;而另一類問題則是分析方法本身造成的問題,如出現色譜峰形狀不好、峰與峰之間不能分開、基線飄移等等。不幸的是,如果出現這類問題,看起來似乎很明顯,但是要找出原因并解決這類問題卻非常困難。

為了減少出現這一類型的問題,就必須在分析之前,仔細研究并選擇一個好的分析方法,有了一個好的分析方法,就很容易獲得理想的分離效果,而且在出現問題是也很便于找出原因。要選擇一個好的分析方法,就必須對液相色譜分析的一些基本原則要有一個很深的了解。

一:分析方法選擇的基本原則 

假如你想做一頓豐盛的晚餐,首先必須看一下食譜,然后檢查一下你所需的東西是否齊全,如果少了配料還必須去商店購買,這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進行液相色譜分析時,也必須按照一定的程序進行,首先你必須要有專門的儀器和試劑,然后有目的地選擇分析方法,這樣你才可能得到好的分析結果,避免走一些彎路。   

 二:柱子的選擇 

     在液相色譜分析方法中zui重要的就是色譜柱的選擇,色譜分析人員面對幾百種色譜柱,你從何入手呢?

  現在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱,其中以C18 C8柱zui為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲,這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數情況下,使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子(如表一所示),但 C18C8經常是的固定相,C18C8柱兩者之間并無明顯的差別,但在我們實驗室中以常使用的是C8柱。 

 色譜分析人員遇到的多數樣品需要利用反相色譜柱進行分析,但一些樣品可能需要其它的分析技術才能成功地分離。   

三:有機相的選擇 

     獲得成功分離的另一個重要因素就是流動相有機溶劑的選擇,如果使用反相色譜柱可以有三種有機溶劑可以選擇,甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其*的優點,但色譜分析人員很少能預見哪一種溶劑更合適,所以具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見。 

     在我的實驗室中多數工作分析藥物中的成份,其中有些樣品的紫外吸收很弱,所以分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低,但是四氫呋喃的紫外吸收比較強,所以在波長低于240nm時,就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用,但是在低于220nm時,甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空氣之間不發生作用,而四氫呋喃易分解,形成過氧化物,所以使用這種溶劑時須格外小心。一些研究人員發現,在四氫呋喃中加入水可以解決這個問題(4),但它與色譜柱平衡所需的時間比甲醇、乙腈長,而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫呋喃相比,甲醇和乙腈的zui大優點是在柱壓較低的條件下,流速可控制在1-2ml/min之間。   考慮到理想溶劑的特點,如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用,而且使用方便,所以的有機溶劑應是乙腈,當然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。    

四:水相的選擇 

  假如樣品為一般化合物,可以用水作為水相,然而離子化合物在藥物分析時普遍存在,而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個單位。在分析有機酸時,當PH值低于3時,色譜柱一般還比較穩定,然而當PH值高于8時,就需要緩沖液,因為此PH值已經超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見,但是對高PH值物質的分離,很少有這方面的報道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。 

     考慮到樣品的特性及柱子的穩定,建議在分析PH值較高的物質時應使用緩沖液,2.5mM的磷酸鹽緩沖液 (PH=2.5)是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀,那么就必須選擇易揮發的緩沖液,盡管不如真正的緩沖液有用,但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。   

 五:其它的因素 

  在你選擇液相色譜的分析方法時,必須考慮到其它的一些因素,比如溫度。因為溫度變化1度,保留時間將變化1-3%,所以溫度控制十分重要,溫度的變化還影響色譜柱的選擇性,這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時柱溫一般比室溫高一點(35),因為此溫易控制,而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度,從而降低柱壓。有時你需要利用其它的一些方法 ,如在流動相中加入部分特殊的物質,不過我建議在你實在必須時才用這種方法,記住KISS原則(Keep it simple stupid),不要使你的流動相過分復雜

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