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    摘要：建立超液相色譜儀——串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別十字花科植物中硫代葡萄糖苷的分析方法。采用70％甲醇水溶液提取白芥種子中的硫代葡萄糖苷，通過反相C12柱分離，電噴霧一離子阱一飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定。利用硫代葡萄糖苷二級(jí)質(zhì)譜裂解產(chǎn)生的m／z l95，241，259，275，291特征離子和伴隨產(chǎn)生的80，162，163，196，242 Da中性分子丟失規(guī)律，共鑒別出5種硫代葡萄糖苷。
    硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱硫苷）是廣泛存在于十字花科植物中的含硫次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分布于植物的根、莖和葉中。當(dāng)植物細(xì)胞受到破壞（如擠壓、蟲咬等）后，硫苷與植物內(nèi)生的黑芥子酶接觸，降解產(chǎn)生異硫氰酸酯、惡唑烷酮和硫氰酸酯等化合物¨J，其中異硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且對(duì)人畜無害。因此硫苷及其降解產(chǎn)物的研究引起了科學(xué)工作者的濃厚興趣。根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同，目前已發(fā)現(xiàn)約l20種硫苷，其中有多種具有抗癌、抗腫瘤、殺菌和殺蟲活性的異硫氰酸酯，如吳華等比較幾種異硫氰酸酯的殺線蟲活性，發(fā)現(xiàn)烯丙基和丙烯?；惲蚯杷狨ゾ哂辛己玫臍⒕€蟲活性。大量研究表明甲硫基己基異硫氰酸酯等具有良好的抗腫瘤活性，是非常具有潛力的抗癌藥物。
    硫苷的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)方法和現(xiàn)代的儀器分析手段?；瘜W(xué)方法耗時(shí)、誤差大、操作繁瑣，只能測(cè)定硫苷總量。液相色譜法具有很高的分離效率，但對(duì)于硫苷單體鑒別需要對(duì)照品，無法滿足
快速鑒別硫苷的需要。筆者采用超液相色譜一離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，既能分離硫苷，又能準(zhǔn)確、快速鑒別硫苷。對(duì)于硫苷及降解產(chǎn)物的研究具有重要意義，同時(shí)又能夠提高工作效率。1實(shí)驗(yàn)部分
1.1主要儀器與試劑
    超液相色譜儀-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀： LCMS—IT-TOF型，日本島津公司；
    數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，
    真空干燥箱：VD23型，德國(guó)81NDER公司；    電子天平：AUY220型，日本島津公司；
    超聲波清洗器：KS-120E1型
    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-216型，瑞士BUCHl公司；
    臺(tái)式高速離心機(jī)：H-1650型，
    研磨機(jī)：All基本型，德國(guó)IKA公司；    白芥種子：產(chǎn)地為湖北武漢；
    正己烷、氯仿、乙酸銨、甲酸：分析純
    甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司；
    實(shí)驗(yàn)用水為美國(guó)Pall公司Purelab Ultra超純水系統(tǒng)制備的超純水，電阻率為18.2 MQ•cm。
1.2硫代葡萄糖苷提取
    白芥種子在105℃干燥3h，以滅活黑芥子酶保護(hù)硫苷。干燥種子經(jīng)粉碎后，過420μm篩。稱取粗粉約50g于錐形瓶中，依次用正己烷50mL，氯仿50mL各3次除脂。殘?jiān)?jīng)真空干燥，用300mL沸騰的70％甲醇水溶液浸泡，超聲提取30min，連續(xù)2次，合并提取液，靜置至室溫。提取液經(jīng)離心分離，將清液真空下濃縮至原體積的20％。取lmL濃縮液經(jīng)石墨化碳脫色，濾液供超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
1.3流動(dòng)相配制
    用電子天平準(zhǔn)確稱量乙酸銨0.385g，置于1L量瓶中，加入lmL甲酸，用水溶解定容后，經(jīng)0.22μm微膜過濾，超聲波脫氣后使用。
l.4液質(zhì)聯(lián)用分析條件    （1）UPLC條件
    ODS Cl8柱（100mmx 2.1mm，3.5μm，日本島津公司）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A：5mmol／L乙酸銨～1‰甲酸溶液；流動(dòng)相B：甲醇；流動(dòng)相流速：0.2 mL／min；進(jìn)樣體積：20μL；梯度洗脫：0～3 min,98%A；3～25min，98％～20％A；25—30min，20％～20％A；30—35min，20％-98％A。
    （2）MS條件
    ESl負(fù)離子模式；電壓：-3.5kV；霧化氣： N2，流量為1.5 L／min；干燥氣壓力：100kPa；碰撞氣：Ar；檢測(cè)器電壓：1.7 kV；Heat Block溫度：200℃；CDL溫度：200℃；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m／z300~700；母離子掃描范圍：m／z 315～650；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m／z 50~700；離子累積時(shí)間：l0ms； CID碰撞能量：100％；碰撞氣能量：l00％。
2結(jié)果與討論
2.1分析條件選擇
    硫苷在水溶液中是親水性陰離子化合物，在反
相色譜柱中，保留時(shí)間短。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ODS— c18柱上采用流動(dòng)相A（5mmol／L的乙酸銨+0.1％甲酸）和流動(dòng)相B（甲醇）能夠很好分離，并且有很好的質(zhì)譜響應(yīng)。質(zhì)譜Heat Block和CDL溫度采用200℃，溫度過高會(huì)造成硫苷裂解，過低則影響離子化和脫溶劑化效果。為獲得比較豐富的二級(jí)離子碎片信息，CID碰撞能量和碰撞氣能量均采用100％。2.2分析結(jié)果
    按照l.4分析條件檢測(cè)白芥種子提取液，獲取硫苷提取離子流色譜圖及其一、二級(jí)質(zhì)譜圖（見圖1～圖ll）。根據(jù)裂解機(jī)理，并參考文獻(xiàn)[9一l2]，共鑒定出5種硫苷，結(jié)果見表1。

2.3質(zhì)譜碎片離子裂解機(jī)理
    二級(jí)質(zhì)譜特征離子，對(duì)于鑒別硫苷具有重要意義。在MS2中，母離子先后失去S0。（80 Da）和 C6H10O5（162Da）后產(chǎn)生242Da中性分子丟失，氫重排后出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的R-C（SH）一N—O-離子。另一裂解途徑是硫苷上的氫發(fā)生重排后，失去 C6H1105（163Da）和C6H1205S（196Da）中性碎片。與此同時(shí)，二級(jí)質(zhì)譜中還能觀察到m／z l95，241，259，275，291的特征離子，這些離子是由于硫與相鄰碳原子發(fā)生斷裂，并伴有氫重排形成的。
    硫代葡萄糖苷負(fù)離子模式下主要特征二級(jí)碎片離子裂解機(jī)理見圖12
3結(jié)語
    利用液相色譜儀一串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速、、準(zhǔn)確的分離與鑒定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，對(duì)硫代葡萄糖苷二級(jí)質(zhì)譜80，162，163，196，242 Da中性分子丟失和m／z l95，241，259，275，291特征離子裂解機(jī)理進(jìn)行了闡述和總結(jié)，能夠準(zhǔn)確推測(cè)硫代葡萄糖苷化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)于十字花科植物的開發(fā)與利用具有重要意義。

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