【原因1】光毒性對(duì)細(xì)胞造成了損傷

熒光觀察時(shí)，激發(fā)光的波長(zhǎng)越短或光照越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性^*1"，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會(huì)造成出乎意料的影響。

1. *1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時(shí)，指細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧使周圍的細(xì)胞遭受損傷。

2. *2：增益：對(duì)相機(jī)接收的信號(hào)進(jìn)行放大。放大程度越高（調(diào)高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素?cái)?shù)不會(huì)變，但是會(huì)產(chǎn)生噪點(diǎn)。

3. *3：Binning：虛擬地結(jié)合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號(hào)的功能。噪點(diǎn)較調(diào)高增益時(shí)更少，但是像素?cái)?shù)會(huì)減少。

【原因2】沒有穩(wěn)定供給合適的環(huán)境

多數(shù)細(xì)胞都喜歡與生物體內(nèi)相同的環(huán)境。以人類細(xì)胞為例，在培養(yǎng)室及培養(yǎng)用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒有穩(wěn)定供給這一條件，細(xì)胞就會(huì)衰弱，很難獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

【原因3】菌、污染造成的影響

有的細(xì)胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實(shí)驗(yàn)用器械可能也會(huì)導(dǎo)致支原體污染^*4、交叉培養(yǎng)污染 ^*5。

【原因1】溫度漂移^*7導(dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)，設(shè)定出錯(cuò)

如果在接通裝置電源后馬上進(jìn)行拍攝設(shè)定，焦點(diǎn)在設(shè)定期間可能就會(huì)發(fā)生偏移。這是因?yàn)榻油娫春蟮囊欢螘r(shí)間內(nèi)，容器內(nèi)的培養(yǎng)液會(huì)發(fā)生對(duì)流，細(xì)胞也會(huì)移動(dòng)。觀察設(shè)備等也會(huì)因溫度變化而出現(xiàn)一定的膨脹現(xiàn)象，使焦點(diǎn)發(fā)生偏移。在觀察漂浮細(xì)胞、粘附細(xì)胞時(shí)，都需要注意拍攝設(shè)定中與拍攝中的溫度偏差。

【原因2】分裂時(shí)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

活著的細(xì)胞在分裂時(shí)尤其會(huì)朝上下方向（Z方向）運(yùn)動(dòng)。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進(jìn)行單次自動(dòng)對(duì)焦拍攝，焦點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移。

1. *8：景深：表示對(duì)焦的范圍。一般NA越高景深越淺。

2. *9：Z棧的設(shè)定范圍：Z棧是對(duì)不同的Z位置數(shù)據(jù)進(jìn)行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動(dòng)步徑越小，可獲得的信息越多，但是細(xì)胞的損傷也相應(yīng)地增加，因此希望以盡可能少的張數(shù)進(jìn)行設(shè)定。

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【原因】細(xì)胞動(dòng)了

實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細(xì)胞是活著的，就無法避免這一問題。相信大家都在各類論文中讀到過觀察細(xì)胞細(xì)節(jié)的數(shù)據(jù)。其中的絕大多數(shù)，都是通過高倍率反復(fù)進(jìn)行多次拍攝后獲得的結(jié)果，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力。

要切實(shí)避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點(diǎn)，或者是讓視野追隨移動(dòng)的細(xì)胞進(jìn)行拍攝。

1. *10：曝光時(shí)間和圖像抖動(dòng)：調(diào)弱激發(fā)光，曝光時(shí)間自然變長(zhǎng)。如果在打開快門期間細(xì)胞動(dòng)了，圖像就會(huì)抖動(dòng)。要防止這種現(xiàn)象，使用高靈敏度的相機(jī)是一種有效的辦法。

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