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葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)試劑盒說明書

閱讀:496      發布時間:2023-11-02
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葡萄糖氧化酶(glucose oxidaseGOD試劑盒說明書

                                      微量法100/48

 

 

   意 :正式測定前取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

GODEC 1.1.3.4)廣泛存在于動物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并產生H2O2,是生物體中產生活性氧的代謝途徑之一。

 

測定原理

GOD催化產生H2O2過氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶聯酚,生成有色化合物,在500 nm有特征吸收峰,顏色深淺與GOD活性成線性關系。

試驗中所需的儀器和設備

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

 

試劑的組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

緩沖液:液體30mL×1瓶,4保存;

試劑一:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用;用不完的試劑4℃保存一個月;

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用;用不完的試劑4℃保存一個月;

 

樣品測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至500nm,蒸餾水調零。

2、   試劑一和試劑二的配制:參見試劑的組成和配制。

3、煮沸樣本的準備:取200μL樣本至新的EP管中,95℃水浴10min,冷卻至室溫后,8000g 4離心10min,取上清作為對照管的煮沸樣本待測。

4、測定操作表

試劑(μL

對照管

測定管

樣本


50

煮沸樣本

50


試劑一

75

75

試劑二

75

75

混勻,35'C保溫15min,于500nm波長處讀取吸光度。ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。

 

GOD活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

回歸方程為y = 2.8348x - 0.0169xH2O2標準品濃度(μmol/mL),y為ΔA

1、血清(漿)GOD活力的計算

單位定義mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/mL= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷V÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169)

2、細菌、細胞或組織GOD活力的計算

1)按蛋白濃度計算

單位定義mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/mg prot=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(V×Cpr) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/g鮮重=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(W×V÷V樣總) ×1000÷T

=58.8×(ΔA+0.0169)÷W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/104 cell=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V反總÷(500×V÷V樣總) ×1000÷T

=0.118×(ΔA+0.0169)

V反總:反應體系總體積,0.125mL V樣:加入樣本體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 min Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

 

 b.96孔板測定的計算公式如下

回歸方程為y = 1.4174x - 0.0169xH2O2標準品濃度(μmol/mL),y為ΔA

1、血清(漿)GOD活力的計算

單位定義mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/mL= (ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷V÷T×1000=118×(ΔA+0.0169)

2、細菌、細胞或組織GOD活力的計算

1)按蛋白濃度計算

單位定義mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/mg prot=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(V×Cpr) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/g鮮重=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(W×V÷V樣總) ×1000÷T

=118×(ΔA+0.0169)÷W

 

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol H2O2為一個酶活力單位。

GODnmol/min/104 cell=(ΔA+0.0169) ÷1.4174×V反總÷(500×V÷V樣總) ×1000÷T

=0.235×(ΔA+0.0169)

V反總:反應體系總體積,0.125mL V樣:加入樣本體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,15 min Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500

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