H2S含量測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
H2S是一種新型氣態信號分子，存在于腦內的神經遞質，生理濃度的H2S對神經系統海馬的長時程增強功能具有重要的調節作用，并對自發性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發揮著重要的病理生理效應。
測定原理：
H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應生成亞甲基藍，亞甲基藍在665nm處有最大吸收峰，通過測定其吸光值可計算H2S含量。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、酶標儀、96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體16mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體1.5mL×1管，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）：直接測定。
操作表：
1、 酶標儀預熱30min，調節波長至665nm。
2、 操作表
空白管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 150 | |
H2O（μL） | 150 | |
試劑一（μL） | 150 | 150 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑二（μL） | 150 | 150 |
10000g，4℃，離心10min，去上清，留沉淀 | ||
H2O（μL） | 150 | 150 |
10000g，4℃，離心10min，去上清，留沉淀 | ||
試劑一（μL） | 75 | 75 |
試劑三（μL） | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑四（μL） | 75 | 75 |
10000rpm，4℃，離心10min，吸取200μL上清于96孔板中 | ||
試劑五（μL） | 10 | 10 |
混勻，25℃靜置5min，測定665nm吸光值，記為A測定和A空白，ΔA=A測定-A空白。 | ||
H2S含量計算公式：
用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y = 0.0022x，R2 = 0.9988
（1）組織樣品
a.按照蛋白濃度計算
H2S（nmol/mg prot）=
×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr
b.按照樣本重量計算
H2S（nmol/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W
(3) 細胞
H2S（nmol/104 cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量(萬個)）=681.8×ΔA÷細胞數量（萬個）
（2）液體樣品H2S（nmol/mL）=×V反總÷V樣= 681.8×ΔA
V反總：反應總體積，0.225mL；V樣：反應中樣品體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
注意事項：
Z低檢出限為1nmol/mL。
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