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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)試劑盒說明書

閱讀:453      發布時間:2023-10-13
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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶GCL)試劑盒說明書

                                                 微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GCL GSH 合成的限速酶,GSH GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節,如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

 

測定原理:

ATPMg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同時ATP去磷酸化產生無機磷分子,通過測定無機磷增加速率,即可計算出GCL活性。

 

自備儀器和用品:

冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體105mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四:液體7mL×1瓶,室溫保存。

試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水,充分震蕩溶解后,緩緩加入400µL濃硫酸(自備),邊加邊攪拌。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4離心10min,取上清,置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

GCL測定操作:

1.        分光光度計/酶標儀預熱30min,調節波長到660nm,蒸餾水調零。

2.        空白管:取1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A空白管。

3.        測定管:1.5mLEp管,依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL,混勻后蓋緊,37℃水浴準確反應15 min;再加入試劑四60µL,混勻后,室溫(25℃左右)8000g,離心10 min,

 

4.        取上清100µL,加入試劑五100µL,混勻后蓋緊,45℃水浴10min,冷卻后測定660nm處光吸收,記為A測定管。

注意:空白管只需要測定一次。

 

GCL活性計算公式:

標準曲線:y=0.1427x,R2=0.9987

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:37下,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /mg prot=[A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V)÷T

=3.815×A測定管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37下,每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCLμg/min /g 鮮重= [A測定管-A空白管)÷0.1427×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測定管-A空白管)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:37下,每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位

GCLμg/min /104 cell=[A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

= 3.815×A測定管-A空白管)÷細胞數量

4)按照液體體積計算

活性單位定義:37下,每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /mL=  [A測定管-A空白管)÷ 0.1427×V反總]÷V÷T

=  3.815×A測定管-A空白管)

0.1427:回歸方程系數;V反總:反應總體積(mL196 µL=0.196 mLCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL; V樣:加入反應體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;W:樣本質量,g;T:反應時間:15min

 

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y=0.07135x,R2=0.9987

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:37下,每毫克蛋白每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /mg prot= [A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V)÷T

=7.63×A測定管-A空白管)÷Cpr

2)按樣本質量計算

活性單位定義:37下,每克組織每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCLμg/min /g 鮮重=  [A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(W×V÷V樣總)÷T

= 7.63×A測定管-A空白管)÷W

3)按細胞數量計算

活性單位定義:37下,每104個細胞每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCLμg/min /104 cell=[A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷(細胞數量×V÷V樣總)÷T

= 7.63×A測定管-A空白管)÷細胞數量

 

4)按照液體體積計算

活性單位定義:37下,每毫升液體每分鐘催化產生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位

GCLμg/min /mL= [A測定管-A空白管)÷0.07135×V反總]÷V÷T

=7.63×A測定管-A空白管)

0.07135:回歸方程系數;V反總:反應總體積(mL196 µL=0.196 mLCpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL V樣:加入反應體系中上清液體積,24µL =2.4×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間:15min。

 

注意事項:

1)樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力,以免影響其活力。如果是勻漿液,避免反復凍融。

2)所有試劑配制完后,除表明4℃保存外,請于1天內用完。

3)實驗過程請帶手套,試劑三中有強腐蝕性物質,注意不要濺到皮膚上或眼睛內。

4)測定吸光值時請于水浴后1040分鐘內測完。

5)樣本測定前先取1-2個樣做預實驗,如吸光值太高,應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數,使得吸光值在標準曲線范圍內,哺乳動物組織和血液一般稀釋35倍。

6)試劑三配制過程中,可能會產生黑色固體,其不影響結果,注意吸取時不要將黑色固體吸入。

7)細胞中GCL活性測定時,細胞數目須在300-500萬之間,細胞中GCL的提取時可加試劑一(或生理鹽水)后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞

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優利科(上海)生命科學有限公司

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