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α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒說明書

閱讀:1081      發布時間:2023-06-11
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α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒說明書

                                        微量法100/96

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

α-KGDHEC 1.2.4.2)廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中,是三羧酸循環調控關鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A

 

測定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A 二氧化碳和 NADHNADH340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑的組成和配制

試劑一:100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:20mL×1瓶,-20保存;

試劑三:1.5mL×1支,-20保存;

試劑四:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1瓶,-20保存;

試劑六:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g4離心5min

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g4離心10min

4、   上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。

5、   在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體α-KGDH活性測定。

 

測定步驟

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min現配現用

2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A1 2min20s后的吸光值A2計算ΔA=A2-A1

 

α-KGDH活性計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

 α-KGDHnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1 按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2 按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性nmol/min/g 鮮重)[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W

3 按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmolNADH定義為一個酶活性單位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mLT:反應時間,2minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500萬。

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