亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內，是自然界氮循環過程中的關鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環境中亞硝態氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
測定原理：
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2—減少，即540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品：天平、研缽、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。
試劑的組成和配制：
提取液：液體112mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL蒸餾水溶解。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑四：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解）
試劑五：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：臨用前根據用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
酶液提取：
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2．細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
測定操作表：
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
樣本（μL） | 20 | 20 | |
蒸餾水（μL） | 20 | 40 | |
試劑一（μL） | 40 | 40 | |
試劑二（μL） | 40 | 40 | 40 |
混勻后，25℃反應1h | |||
試劑三（μL） | 40 | 40 | 40 |
充分震蕩30S | |||
上清液（μL） | 70 | 70 | 70 |
工作液（μL） | 140 | 140 | 140 |
充分混勻，，靜置3min后測定各管540nm處吸光值，分別記為A空白管、A對照管、A測定管。空白管只要做一管，每個測定管需設一個對照管。 | |||
計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。
1．按照蛋白含量計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（V樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷W
3. 按照細胞數量計算
酶活單位定義：每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T = 1.47×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷細胞數量
V標：標準液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值（A標準管-A空白管）。
1．按照蛋白含量計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（V樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（W ×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷W
3. 按照細胞數量計算
酶活單位定義：每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷0.6797×V標÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T = 2.94×（A空白管-A測定管+A對照管-0.0072）÷ 細胞數量
V標：標準液體積，0.04mL；V樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質量，g
注意事項：
1. 配制好的工作液3天內使用完。
2. 若吸光值超過1.5，將上清液進行適當的稀釋后再加入工作液顯色，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
3. 嚴格控制顯色時間，否則會對結果有影響。
4. 標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A空白管-（A測定管-A對照管）線性范圍為0.02-1.5。
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