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脯氨酸脫氫酶(ProDH)試劑盒說明書

閱讀:448      發(fā)布時(shí)間:2023-04-03
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脯氨酸脫氫酶 Proline dehydrogenaseProDH)試劑盒說明書

                                       微量法100/96


   正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

ProDH是存在于線粒體內(nèi)的催化脯氨酸降解的關(guān)鍵酶。脯氨酸是分布Z廣泛的一種滲透物質(zhì),在脅迫條件下很多植物可以通過增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸,降低ProDH活性對(duì)于調(diào)節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對(duì)植物造成傷害、清除自由基、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重要意義。

測定原理:

利用異硫氰酸甲酯檢測ProDH催化的脫氫反應(yīng),600nm處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2 mL×1支, 4保存;

試劑二:液體25mL×1瓶, 4保存;

試劑三:粉劑×1瓶, 4保存;臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存;

試劑四:粉劑×1瓶, 4保存;臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存;

試劑五:粉劑×4支,4保存;

 

粗酶液提取:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,1500g 4離心15min,取上清液于一支新的EP管中,加入一滴試劑一(用10μL的槍頭加入),渦旋混勻,冰浴放置30min后,16000g 4離心20min,取上清置冰上待測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至600nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

1混合液的配制:首先將試劑三和試劑四配成溶液(見試劑的組成和配制),臨用前根據(jù)用量按照試劑二(V):試劑三(V):試劑四(V=2.4mL):0.3mL):0.3mL)的比例充分混勻。(注意:現(xiàn)配現(xiàn)用,用多少配多少)置于30℃水浴5min

2)試劑五的配制:取試劑五一支,臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入35μL樣本、15μL試劑五和150μL混合液,混勻,立即記錄600nm處初始吸光值A110min后的吸光值A2計(jì)算ΔA=A2-A1

 

ProDH活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

 

酶活力單位。

ProDHU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

ProDHU/g 鮮重=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL V樣:加入樣本體積,0.035mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,10 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g

 

b.96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

ProDHU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.005÷T =114.29×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

ProDHU/g 鮮重=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.005÷T =114.29×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mLV樣:加入樣本體積,0.035mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,10 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g

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