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實時熒光定量PCR擴增的分類有哪些?

閱讀:1059      發布時間:2022-7-21
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  實時熒光定量PCR擴增是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光集團,利用熒光信號來實時監測整個PCR進程,然后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。
 
  病原學檢測是動物疾病確診的關鍵點,而聚合酶鏈式反應(PCR)是目前病原檢測的常用的分子生物學技術,具有高敏感性的特征。PCR技術發展已日趨完善,并在此基礎上建立了實時熒光定量PCR、套式、多重、降落PCR等技術,逐漸成為實驗室常規檢測手段。
 
  實時熒光定量PCR擴增是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團,通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
 
  熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光信號指數擴增階段,PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,可以選擇在這個階段進行定量分析。為了方便定量和比較,在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和CT值。
 
  熒光定量PCR的分類:
 
  分為核酸染料法和探針法。核酸染料法實驗設計簡單,不需要設計探針,僅需要一對引物,但是核酸染料法對雙鏈的結合并沒有特異性,容易使實驗結果出現假陽性信號。
 
  動保站全部采用探針法,此方法只有與探針結合的片段上發生擴增才能收集到熒光信號,增加了反應的特異性;另外如果對探針的5’端采用不同的熒光標記就可以進行多重熒光定量PCR。

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