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細胞電轉實驗的主要影響因素有哪些?

時間:2024/5/10閱讀:346
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1、細胞密度對電轉的影響
 
細胞系電轉的細胞密度最好在0.5M-2.0M/20ul,或2.5M-10M/100ul. 常用1M/20ul. PBMC直徑更小,細胞密度一般為1M-5M/20ul, 或5M-25M/100ul。細胞密度越高可以增加細胞間電流輔助,從而增加細胞的有效電轉面積。密度高時電壓需要稍微調高一些,所以電轉時細胞密度根據實驗需要選定后盡量不要變化。
需要特別注意的地方:一個樣品加進電擊管后,不要等候,馬上進行電轉,完成后再處理下一個樣品,不要把一批樣品全部加樣完成后再一起電轉。等候時間過長,細胞沉降也會導致電擊管內上下細胞密度不均勻而降低電轉效率。電轉完成后細胞可以馬上取出培養(yǎng),也可以等全部樣品處理完畢再取出培養(yǎng)。
 
2、細胞聚團對電轉的影響
 
當細胞聚團時,其中只有一側細胞可以被電轉,中間和另一側細胞不能被電轉,降低電轉效率。所以消化細胞過程中注意細胞不要成團。
 
3、溫度對電轉的影響
 
溫度對電轉影響也很大。一般室溫(23度)適宜進行電轉實驗。溫度越低,需要電壓越高。4度電轉比室溫23度電轉大概需要增加3%到5%的電壓。所以為保證電轉實驗結果可重復性,需要將每次的電轉溫度保持一致。
 
4、DNA質量對電轉的影響
 
DNA越純凈,越有利于電轉。DNA中雜質較多時,細胞毒性大,非常不利于電轉。市場上在售的品牌質粒提取試劑盒一般都可以。DNA加得比較多時,電轉效率呈線性遞增。但是電轉時DNA加的過高也會產生細胞毒性,電壓需要稍微下調。所以DNA濃度應根據實驗需要相應調整,濃度范圍一般在10ug/ml-200ug/ml。

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