生物安全柜是為操作原代培養物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠混合濺出物而設置的。
生物安全柜若使用不當會引起很多危害，因此，在使用該設備之前需要理清生物安全柜正確的使用方法。在操作前應將本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免雙臂頻繁穿過氣幕破壞氣流，并且在移入前要用75%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。
打開風機5~10分鐘后，待柜內空氣凈化并在氣流穩定后再進行實驗操作，將雙臂緩緩伸入安全柜內，至少靜止1分鐘，使柜內氣流穩定后再進行操作。提醒，生物安全柜內不放與實驗無關的物品。
柜內物品擺放應做到清潔區、半污染區與污染區基本分開，操作過程中物品取用方便，且三區之間無交叉。另外，物品應盡量靠后放置，但不得擋住氣道口，以免干擾氣流正常流動。
在操作時，應按照從清潔區到污染區進行，以避免交叉污染。而為了防止可能濺出的液滴，可以在臺面上鋪上用消毒劑浸泡過的毛巾或紗布，但不能覆蓋住安全柜格柵。設備使用期間，嚴禁使用酒精燈等明火，以避免產生的熱量產生氣流，干擾柜內氣流的穩定。
工作時也要盡量減少背后人員走動以及快速開關房門，以防止安全柜內氣流不穩定。此外，在實驗操作時，不可打開玻璃視窗，應保證操作者臉部在工作窗口至上。在柜內操作時動作應該輕柔、舒緩，防止影響柜內氣流。當設備使用完畢后，可關閉玻璃窗，保持風機繼續運轉10~15分鐘，同時打開紫外燈，照射30分鐘。
另外，生物安全柜還要定期進行檢測與保養，以保證其正常工作。除了定期檢測與保養外，還要定期進行清潔消毒。“生物安全柜內臺面污染物可以在工作完成且紫外燈消毒后用2%的84消毒液進行擦拭，柜體外表面則應每天用1%的84消毒液擦拭。"
對于操作者而言，當進行高危險性操作時，例如生物安全水平2+到3級操作時，應選用長、背面開口的隔離衣和兩副手套，并確保外層手套套住隔離衣口，且不能有暴露在外的肌膚。
與此同時，操作者也要遵循清潔區到污染區的操作原則。一般而言，生物安全柜的工作區應該被依次劃分為三個區域：清潔區、工作區和污染區。
生物危害性廢棄物袋應放置在污染區內;實驗儀器和樣品應放置在工作區域內;而實驗供給品應放置在潔凈區內。在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區到污染區的方向進行。
需要注意的是，生物安全柜應盡量遠離外部氣流干擾因素，例如門窗、空調通風口、人員國道以及其他實驗室氣流干擾設備(安全柜、通風櫥等)。操作者也要確保安全柜在工作時前窗處于正確的額定操作高度，切勿阻塞工作區前后的通風格柵，盡量在工作區的中心部位進行操作。
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