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 維持培養細胞旺盛生長,有恒定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養溫度要求也不同，例如魚、昆蟲和兩棲類細胞的適宜培養溫度是25-28℃，哺乳動物細胞的適宜培養溫度是35-37℃，發生轉化的細胞則適合在高于40℃的條件下生長。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃,偏離這一溫度范圍,細胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡。保持培養箱內恒定的溫度是維持細胞健康生長重要因素。CO2培養箱的溫度是通過電熱絲加熱的, 主要有水套式加熱和氣套式加熱兩種加熱系統。 
（1）水套式加熱 水套式加熱是通過一個獨立的水套層包圍內部的箱體來維持溫度恒定的，其優點：水是一種很好的絕熱物質，當遇到斷電的時候，水套式系統就可以比較長時間的保持培養箱內的溫度準確性和穩定性，有利于實驗環境不太穩定（如有用電限制或經常停電）的用戶選用。 
（2）氣套式加熱 氣套式加熱是通過遍布箱體氣套層內的加熱器直接對內箱體進行加熱的，又叫六面直接加熱。氣套式與水套式相比，具有加熱快，溫度的恢復比水套式培養箱迅速的特點，有利于短期培養以及需要箱門頻繁開關取放樣的培養。此外，對于使用者來說氣套式設計比水套式更簡單化（水套式需要對水箱進行加水、清空和清洗，并要經常監控水箱運作的情況，還有潛在的污染隱患）。
氣套式加熱優點總結：
1.重量更輕、運輸或搬運更方便；
2.加熱快，溫度的恢復比水套式培養箱迅速，有利于短期培養以及需要箱門頻繁開關取放樣的培養；
3.不會發生因為漏水造成樣品污染；
4.可選擇更多滅菌方式（水套利用水作為傳熱介質，高溫加熱滅菌困難）。 為了滿足低溫培養的需求，二氧化碳培養箱廠家勵精圖治開發出了內置制冷系統的產品可供研究者選擇， 
5如何滿足細胞培養濕度的要求 水是細胞的重要組成部分，在培養箱中對細胞進行培養過程里，制冷或者制熱直接的影響是細胞的培養基快速蒸發失水，蒸發將導致培養基上的滲透作用增強，產生滲透性脫水；培養基中鹽濃度增加，細胞中水分跑出細胞外細胞收縮，新陳代謝變緩，細胞死亡。 培養箱內相對濕度的控制室重要的，飽和濕度環境可以避免培養液中二氧化碳逃逸，保持pH值穩定，也能防止由于干燥使培養液中水分蒸發，滲透壓升高，導致細胞培養失敗。大多數的二氧化碳培養箱是通過增濕盤的蒸發作用產生濕氣的，大型的二氧化碳培養箱是用蒸汽發生器或噴霧器來控制相對濕度水平的。一些培養箱在底部設置濕度蓄水池，這樣可以增強蒸發作用，但是，這個系統也更復雜，由于復雜結構的增加一些難以預料的問題也會在使用過程中出現。