脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在保護(hù)mRNA并促進(jìn)其進(jìn)入靶細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)合成方面表現(xiàn)出色。然而，細(xì)胞攝取LNPs后，mRNA的翻譯效率不僅取決于LNPs的遞送效率，還受到細(xì)胞內(nèi)必需代謝物（如代謝能量源、輔酶和氨基酸）可用性的影響。本研究提出了一種代謝物共遞送策略，通過將關(guān)鍵代謝物封裝在mRNA LNPs中，以提高mRNA的翻譯效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與不含代謝物的LNPs相比，共遞送ATP和GTP的LNPs在體外和體內(nèi)均顯著提高了mRNA編碼蛋白的表達(dá)水平，尤其在缺氧條件下效果更為顯著。這一策略為改善mRNA LNP療法提供了新的思路。
結(jié)果與討論
本研究選擇了四類關(guān)鍵代謝物進(jìn)行共遞送，包括核苷酸/核苷酸衍生物（ATP、GTP、ADP、AMP、焦磷酸）、氨基酸（L-His）、輔酶（NAD、FAD、NADH）和碳水化合物（葡萄糖）。通過微流體混合技術(shù)制備了包含這些代謝物的LNPs，并對其進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，LNPs的粒徑在157-187 nm之間，多分散性指數(shù)（PDI）在0.14-0.26之間，表面電荷（ζ電位）在-3.5-1.5 mV之間，這些參數(shù)與不含代謝物的LNPs相似，表明代謝物的加入并未顯著影響LNPs的物理性質(zhì)。此外，mRNA的封裝效率在63.0-90.0%之間，各代謝物的封裝效率在5.0-68.9%之間，表明代謝物被成功封裝在LNPs中。螢火蟲熒光素酶（FLuc）表達(dá)：在常氧（21%氧氣）和缺氧（1%氧氣）條件下，評估了不同代謝物共遞送的LNPs對FLuc表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在常氧條件下，共遞送GTP和ATP的LNPs顯著提高了FLuc的表達(dá)水平，分別比不含代謝物的LNPs提高了約9倍和8倍（圖2b）。相比之下，共遞送氨基酸、輔酶和碳水化合物的LNPs對FLuc表達(dá)水平的提升不顯著（圖2b）。在缺氧條件下，共遞送GTP和ATP的LNPs仍然顯著提高了FLuc的表達(dá)水平，分別比不含代謝物的LNPs提高了約19倍和16倍（圖2c）。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)：通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧條件下均顯著提高了EGFP的表達(dá)水平。在常氧條件下，與不含代謝物的LNPs相比，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)（圖2d）。在缺氧條件下，這一趨勢同樣明顯（圖2e）。人促紅細(xì)胞生成素（EPO）表達(dá)：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）評估，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧條件下均顯著提高了EPO的表達(dá)水平。在常氧條件下，與不含代謝物的LNPs相比，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞上清液中EPO的濃度分別提高了約3倍和2.5倍（圖2f）。在缺氧條件下，這一提升效果更為顯著，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞上清液中EPO的濃度分別提高了約4倍和3.5倍（圖2g）。
1.3 機(jī)制研究結(jié)果：
細(xì)胞黏附與攝取：通過流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs顯著增加了細(xì)胞黏附與攝取。與不含代謝物的LNPs相比，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞顯示出更高的幾何平均熒光強(qiáng)度（GMFI），表明更多的LNPs被細(xì)胞攝取（圖3a, b）。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞內(nèi)紅色熒光信號(hào)（代表Cy5標(biāo)記的FLuc mRNA）更強(qiáng)（圖3c, d）。內(nèi)吞機(jī)制：通過使用特定的內(nèi)吞抑制劑（EIPA、NaN?和細(xì)胞松弛素D），探究了不同LNPs的內(nèi)吞途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共遞送GTP和ATP的LNPs主要通過能量依賴的內(nèi)吞途徑被細(xì)胞攝取（圖3e-g）。這一發(fā)現(xiàn)為理解我們的代謝物共遞送策略如何影響LNPs的細(xì)胞攝取提供了重要線索。內(nèi)涵體逃逸：通過共聚焦顯微鏡和Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）分析，評估了不同LNPs的內(nèi)涵體逃逸特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共遞送GTP和ATP的LNPs在內(nèi)涵體逃逸方面表現(xiàn)出更好的特性，PCC值顯著低于不含代謝物的LNPs（圖4c）。此外，通過鈣黃綠素泄漏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞中鈣黃綠素信號(hào)更廣泛地分布于細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步證實(shí)了其更好的內(nèi)涵體逃逸特性（圖4d）。
1.4 體內(nèi)療效與耐受性評估結(jié)果：
體內(nèi)FLuc表達(dá)：在雌性C57BL/6小鼠中通過尾靜脈注射評估不同LNPs的體內(nèi)療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共遞送GTP和ATP的LNPs顯著提高了FLuc在肝臟和脾臟中的表達(dá)水平（圖5a, b）。特別是ATP共遞送的LNPs，其FLuc信號(hào)強(qiáng)度顯著高于不含代謝物的LNPs（圖5b）。此外，代謝物共遞送策略并未改變LNPs的天然生物分布特性（圖5c）。體內(nèi)EPO表達(dá)：通過ELISA評估血清中EPO的濃度，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP、ATP和AMP的LNPs顯著提高了EPO的表達(dá)水平（圖5d）。這一結(jié)果表明，代謝物共遞送策略在體內(nèi)同樣能夠有效提高mRNA編碼蛋白的表達(dá)水平。耐受性評估：通過組織學(xué)評估、血液檢測和體重保留研究，發(fā)現(xiàn)代謝物共遞送策略在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的耐受性。組織學(xué)評估結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠主要器官（肝臟、脾臟和肺）未出現(xiàn)明顯的組織損傷或炎癥反應(yīng)（圖5e）。血液檢測結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠血液生化指標(biāo)（如堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮和肌酐）與PBS對照組無顯著差異（圖5f）。此外，體重保留研究結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠體重與PBS對照組無顯著差異（圖S9）。這些結(jié)果表明，代謝物共遞送策略在體內(nèi)是安全且可耐受的。結(jié)論
本研究提出了一種代謝物共遞送策略，通過將關(guān)鍵代謝物封裝在mRNA LNPs中，顯著提高了mRNA的翻譯效率。共遞送ATP和GTP的LNPs在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，尤其在缺氧條件下效果更為顯著。此外，這些LNPs還顯示出良好的耐受性。未來研究將進(jìn)一步探討ATP和GTP如何改善LNP的遞送效率，并評估該策略在其他疾病模型中的應(yīng)用潛力。
參考文獻(xiàn)：Ma, Yutian, et al. "A Metabolite Co-Delivery Strategy to Improve mRNA Lipid Nanoparticle Delivery." ACS Applied Materials & Interfaces (2025).
