分子克隆實驗---第三章：測序結果解讀

時間：2025/3/31閱讀：601

一代測序是克隆實驗中常見的下游實驗。現代 DNA 測序技術源于 Sanger 鏈末端終止測序法，其工作原理與 Sanger 測序不同的是 4 組反應的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標記，每個試管的產物在光激發下發出不同顏色的熒光，延伸反應和鏈終止完成后，將全部 4 組反應物混合，在同一泳道進行凝膠電泳，通過激光束激發熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測序分析。

一般情況下，測序信號文件多為 *.ab1 文件，該文件能夠得到每個堿基的測序峰型及整體質量；*.seq 文件則為 ab1 文件導出得到的測序結果序列，ab1 文件中已具有堿基序列信息，因此 *.seq 文件可不作重點關注。

一代測序的每次測序反應能夠產生約 600-900bp 堿基信息，測序開始的 5’ 端約 50bp 左右的測序信號不穩定，檢測 800bp 左右之后信號開始衰減，各種波之間有重疊等情況。這部分結果信息不準確，不建議參考使用。

理想狀態的測序信號應當是獨立單一的峰形信號，波峰與波谷清晰，峰與峰之間的距離均勻，波峰底部沒有雜峰干擾，此時得到的堿基信息可信度超高；測序信號出現雙峰、套峰等情況時，該處堿基信息可信度低，需要其他測序結果共同比對分析

測序問題的主要原因：
◆ 套峰
a) 全雙峰：多引物結合位點（菌液、質粒）；非特異擴增（PCR 產物）；
b) 前雙峰：多引物結合位點，其中一套模板測序中斷（菌液、質粒）；多引物結合位點（PCR
擴增未純化產物）；引物二聚體或小片段干擾（PCR 產物純化非切膠樣品）；
c) 中間雙峰：非單克隆（菌液、質粒）；堿基缺失或等位基因雙模板（PCR 擴增未純化產物）；
d) 后雙峰：非單克隆（菌液、質粒）；堿基缺失（PCR 產物）。

◆ 測序信號

a) 無信號：引物結合位點不存在或被破壞；
b) 信號差：引物或模板的質量不高，或引物和模板匹配性低，或樣本濃度偏低；
c) 信號衰減：可能因測序序列的特殊結構導致，如 Poly 結構、重復序列、回文結構、發卡結構、GC 富集、AT 富集等；若為正常峰形后逐漸衰減，可能模板反應量不足；
d) 信號中斷：模板存在高級結構，導致 dNTP 和 ddNTP 在某位點無法與模板結合；
e) 測序移碼：測序開端移碼可能是引物降解，局部移碼可能樣本存在高級結構；

f) 測序底峰干擾：可能測序引物不純；可能測序樣品不純混有正、反向引物。

優化方案：套峰

二聚體、小片段干擾：凝膠電泳，切膠純化回收；
多引物結合位點：更換引物測序或反向測通；
堿基缺失：構建單克隆后測序；
非單克隆：在載體構建克隆正確下重新挑取單克隆測序；
非特異性擴增：優化反應條件重新制備；

等位基因雙模板：構建單克隆后測序。

測序信號

無信號：更換引物或重新提供樣品測序；
信號差：提供高質量樣品測序；
信號衰減：特殊結構導致衰減，建議反向測序拼接；若正常峰形后逐漸衰減：提供高質量樣品；
測序中斷：建議反向測序測通；
測序底峰干擾：重新制備模板，引物 PAGE 膠純化。

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