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植物原生質體的制備

時間:2023/1/29閱讀:1692
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原理

去掉植物細胞壁的方法可以是機械的人工操作,也可以利用酶解法。較早利用機械法制備原生質體的首-推Klercker(1892),直到1960 年英國科學家Cocking 才第一次用酶法大量制備原生質體。本實驗以植物的葉肉組織為材料,利用纖維素酶和果膠酶來消化細胞壁,分離細胞。

材料與儀器

油菜或菠菜或煙草
氯化鈣 蒸餾水 2蔗糖 酶解液
顯微鏡 離心機 離心管 剪刀 鑷子 吸管 培養皿 載玻片 蓋玻片

步驟

1、取材 根據實驗目的和條件選取不同的材料

 

2、分離原生質體

 

(1) 撕葉下表皮

 

(2)酶解 將撕去下表皮的葉片剪成小塊,放在盛有5mL 酶液的小培養皿中,讓去除下表皮的一面接觸酶液,輔滿一層,在25——28℃下酶解60——90 分鐘

 

3、收集純化

 

(1)用吸管將酶解液吸至5mL 離心管中,以600rpm 離心5 分鐘以上,使原生質體沉降

 

(2)將上清(酶解液)回收,剩下原生質體及殘渣于管底

 

(3)加氯化鈣液約2mL,輕輕吹打均勻

 

(4)用注射器向離心管底部緩緩注入蔗糖約2—3mL,出現下部蔗糖液,上部原生質體懸浮液

 

(5)以600rpm 離心10 分鐘,在兩液相之間出現一條綠色帶,便是純凈的原生質體

 

4、觀察或培養

 

取少許原生質體于載片上,蓋片觀察其形態,或者將原生質體接種在培養基上進行培養,再生植株。

注意事項

要培養懸浮細胞系需較長時間。因此,應著重改善培養條件,主要包括選用合適 的培養基 包括培養基 種類 、添加物 、激素種類及水平等 及培養方式 根 據培養物狀態適時改換適宜培養基 選擇合適的外植體及誘導時期 。

常見問題

原生質體是裸露的、具有生命活性的細胞,體內包裹著細胞核、細胞器、細胞質等, 因此原生質體具有再生細胞壁、進行連續分裂并生成完整植株的能力 , 即具有細胞全*性。原生質 體能 攝 人 如 DNA、質粒 、病毒 、細菌 、細胞器等外源物質 , 是植物細胞工程進行遺傳操作 、基因轉移的良好材料 。

 

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