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深圳市安培生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第5年

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一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)

時(shí)間:2023/1/13閱讀:1368
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簡(jiǎn)介

目前免疫組化多選用 SABC 法。

一抗是特異性的針對(duì)檢測(cè)蛋白的單克隆或多克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)為兔抗大鼠 iNOS )。

 

二抗是生物素標(biāo)記的針對(duì)一抗的抗體(本實(shí)驗(yàn)為羊抗兔 IgG )。

 

三抗是針對(duì)生物素的鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(streptavidin biotin complex,SABC)。

 

這樣就可以通過(guò)逐級(jí)放大的方式,以過(guò)氧化物酶標(biāo)記要檢測(cè)的蛋白(iNOS)。顯色液為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和雙氧水(H2O2)。

 

顯色原理:過(guò)氧化物酶將 H2O2 分解,產(chǎn)生新態(tài)氧,使 DAB 氧化,生成棕黃色顆粒產(chǎn)物,可根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)判定一氧化氮合酶的有無(wú)或多少。本方法具有靈敏性高,背景低的優(yōu)點(diǎn)。

原理

 一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是一氧化氮合酶按調(diào)控條件分為組構(gòu)型(cNOS)和誘生型(iNOS)。前者按細(xì)胞類(lèi)型又可分為神經(jīng)元組構(gòu)型(nNOS)和內(nèi)皮細(xì)胞組構(gòu)型(eNOS)。前述的組化方法不能區(qū)分上述 NOS 的具體分型,因此可以利用針對(duì)不同類(lèi)型 NOS(nNOS、eNOS、iNOS)的特異性抗體,通過(guò)免疫組化方法進(jìn)行顯示。

材料與儀器

器材:

染色缸、載玻片、蓋片、吸管、吸水濾紙、小鑷子、解剖器材、灌注器材、石蠟切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠或培養(yǎng)的細(xì)胞。

試劑:
①兔抗大鼠 iNOS(一抗)
②羊抗兔 SABC 試劑盒[10%正常山羊血清、羊抗兔 IgG(二抗)、SABC(三抗)]
③3%H2O2-甲醇液
④0.01 mol / L 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)
⑤0.01 mol / L 檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)
⑥ DAB 顯色液(DAB,6 mg ;0.05 mol / L PBS(pH 7.4),10 mL ;30%H2O2,0.01 mL 。過(guò)濾去除沉淀物。用時(shí)現(xiàn)配)
⑦雙氧水
⑧蘇木精染液
⑨梯度乙醇
⑩二甲苯
?4%多聚甲醛
?石蠟
?0.3%Triton X-100。

步驟

一氧化氮合酶免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程可分為如下幾步:

 

(一)腦組織石蠟切片


A.將大鼠常規(guī)灌注固定,取腦組織塊,常規(guī)包蠟塊。

B.石蠟切片,片厚5 μm 。

C.常規(guī)脫蠟入水。

D.0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

E.封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H2O2-甲醇,室溫,15 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

F.抗原熱修復(fù):將切片浸入0.01 mol / L 檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0),用微波爐或電爐熱處理(加熱至95 ℃ 后斷電,間隔5~10 min ,反復(fù)1~2 次 )。自然冷卻后,在0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

G.封閉非特異抗原:向切片上滴加10%正常山羊血清,室溫或37 ℃ ,20~30 min 。甩去多余的血清,不洗。

H.一抗孵育:滴加適當(dāng)稀釋的一抗(兔抗大鼠iNOS),放入濕盒中,4 ℃ ,過(guò)夜。以  PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

I.二抗孵育:滴加生物素化羊抗兔 IgG ,37 ℃ ,30 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

J.三抗孵育:滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC),37 ℃ ,30 min 。0.01 mol / L PBS中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

K.顯色:用 DAB 顯色液顯色,顯微鏡下監(jiān)測(cè),適時(shí)終止。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

L.蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。

(二)細(xì)胞爬片或甩片


A.細(xì)胞爬片或甩片,0.01 mol / L PBS 漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

B.4%多聚甲醛固定,室溫,30 min 。0.01 mol / L PBS 漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

C.封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H2O2-甲醇,室溫,10 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

D.暴露抗原:0.3%Triton X-100,室溫,10 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

E.封閉非特異抗原:滴加10%正常山羊血清,室溫或37 ℃ ,20~30 min 。甩去多余的血清,不洗。

F.一抗孵育:滴加適當(dāng)稀釋的一抗(兔抗大鼠iNOS),濕盒中,4 ℃ ,過(guò)夜。以不加 PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。0.01 mol / L PBS中 漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

 

G.二抗孵育:滴加生物素化羊抗兔 IgG ,37 ℃ ,1 h 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。


H.三抗孵育:滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC),37 ℃ ,1 h 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

I.顯色:用 DAB 顯色液顯色,顯微鏡下監(jiān)測(cè),適時(shí)終止。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重復(fù)3 次 。

J.蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。

注意事項(xiàng)

1.一抗的質(zhì)量是關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素,一定要選用高質(zhì)量的抗體。

2.一抗、二抗、三抗的稀釋濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度是十分重要的環(huán)節(jié)。在實(shí)際操作中,應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室的條件探索合適的制備方法。

 

3.DAB 顯色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,最早在使用前15 min 配制。

4.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中防止出現(xiàn)干片,否則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了正確估計(jì)是否是因?yàn)椴僮鬟^(guò)程造成的人工假象,設(shè)立陰性對(duì)照十分必要。

5.細(xì)胞爬片固定時(shí)采用室溫,是為了防止細(xì)胞脫落。以后每步操作都要小心,防止細(xì)胞脫落。

 

以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊

 

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安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶(hù),提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑;inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等,為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù);提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品;提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專(zhuān)注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。

 

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