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切碎的組織放于含有膠原酶的完-全培養基中孵育，組織分解后，通過離心去除膠原酶，高濃度接種、培養。
膠原酶 DBSS
培養基 移液器 皮氏平皿 培養瓶 離心管 手術刀 離心機
1. 將組織移人新鮮、無菌的 DBSS 中，淸洗。
2. 轉入另一培養皿（9 cm 皮氏平皿，非組織培養級別），切除多余組織，如脂肪或壞死組織。
3. 將組織轉移至第三個平皿中，用交叉的手術刀細切成大約 1 mm3 大小。
4. 用 10~20 ml 廣口移液管將組織移入 15 ml 或 25 ml 無菌離心管或常用的容器， 中（先用 DBSS 濕潤移液管，否則組織塊易貼壁）。
5. 讓組織塊沉降。
6. 用 DBSS 重懸清洗組織，組織塊沉降后，去除上清液，重復此步驟兩次以上。
7. 將 20~30 個組織塊接種于一個 25 cm2 的培養瓶中，另一瓶中接種 100~200 塊。
8. 吸凈 DBSS，每瓶中加入 4.5 ml 含血清的培養基（如 DMEM/F12加10 % 胎牛血清）。
9. 加入 0.5 ml 粗制膠原酶（2000 U/ml，Worthington CLS 或 Sigma 1A），終濃度為 200 U/ml。
10. 于 37°C 培養 4~48 h，無需振蕩。腫瘤組織（如乳腺或結腸的硬癌）由于分解較慢，可作用 5 天或更長時間。有時由于時間過長 pH 過度下降（pH<6. 5），要將組織離心并用新的培養基和膠原酶重懸。
11. 輕輕晃動培養瓶檢查分離情況：組織塊呈點狀分布于培養瓶底部，適當吸打后分散成單一細胞或小的組織塊。
12. 有些組織（肺、腎、結腸或乳腺癌）的部分上皮細胞小團塊對膠原酶耐受，沉淀 2 min 即可與其他剩余組織分離。若將其用 DBSS 重懸，沉淀后將沉淀物接種于培養基中，將形成生長旺盛的上皮細胞島。上皮細胞往往在未完-全解離時存活較好。
13. 完-全分解或組織塊沉降后，收集上清液中的細胞，于 50~100g 離心 3 min（離心管或常規容器，15~50 ml，依據處理組織的量而選擇） 。
14. 去除 DBSS 或培養基上清液，重懸，加入 5 ml 培養基，接種于 25 cm2 培養瓶中。若膠原酶作用時 pH 下降了（pH< 6.5 達 48 h )，去除膠原酶后用 2 倍或 3 倍培養基稀釋細胞懸液。
15. 于 48 h 后更換培養基。
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