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補體介導法

時間:2022/3/11閱讀:1411
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原理


帶有特異抗原的靶細胞(如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞)與相應抗體結合后,在補體的參與下,引起靶細胞膜損傷,導致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料(例如:伊紅-Y、臺盼藍)可通過細胞膜進入細胞內使細胞著色,故可用于指示死細胞或瀕死細胞,而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗,利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原,亦可鑒定抗體的特異性。
 
本實驗中,Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原,在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協同作用,可殺傷95%以上的胸腺細胞。
 


材料與儀器

C57BL/6J小鼠
Hank’s液 單克隆抗體 補體 伊紅-Y染液
眼科剪 眼科鑷 平皿 不銹鋼網 試管 吸量管 尖吸管 載玻片 蓋玻片 顯微鏡

步驟


一、實驗方法
 
1.  小鼠胸腺細胞懸液的制備:將4~6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死,取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中,在100目的不銹鋼網上研磨后,過篩,放入試管,離心1 000 rpm,5分鐘,用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細胞重懸于Hank’s液中,配成1×107/ml細胞懸液。
 
2.  取試管3支,標明順序,依據下表依次加入1×107/ml胸腺細胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液,放入37℃水浴30分鐘。
 
3.  取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴,混勻,室溫放置2分鐘。
 
4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片,加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察,再用高倍鏡觀察,比較3管中細胞死活情況。
 
二、實驗結果
 
死細胞呈紅色,無光澤且腫脹變大;活細胞不著色、有光澤且形態正常。
 
高倍鏡下計數200個細胞并計算其中死細胞的百分數。計算公式如下:死細胞百分數= EQ EQ \F(實驗管死細胞數%-對照管死細胞數%,100%-對照管死細胞數%)


注意事項


1.  胸腺細胞制備速度要快,且需在冰浴中進行操作,以保持細胞活力;
 
2.  抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預實驗中確定;
 
3.  細胞對照管死細胞數若超過5%,實驗需重新做;
 
4.  細胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導致假陽性反應。


常見問題


一、實驗材料
 
1.  解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80~100目不銹鋼網;
 
2.  試管、1 ml吸量管、尖吸管;
 
3.  載玻片、蓋玻片;
 
4.  C57BL/6J小鼠;
 
5.  含5%NBS的冷Hank’s液;
 
6.  抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度,本室制備);
 
7.  補體(豚鼠新鮮血清并經小鼠胸腺細胞吸收,預先測定效價并稀釋為最佳稀釋度);
 
8.  1%伊紅-Y染液。

二、多重PCR的特點


1.高效性


在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物,或對有多個型別的目的基因進行分型,特別是用一滴血就可檢測多種病原體。


2.系統性


多重PCR很適宜于成組病原體的檢測,如肝炎病毒,腸道致病性細菌,性病,無芽胞厭氧菌,戰傷感染細菌及細菌戰劑的同時偵檢。


3.經濟簡便性


多種病原體在同一反應管內同時檢出,將大大的節省時間,節省試劑,節約經費開支,為臨床提供更多更準確的診斷信息。


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