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如何優雅地獲得漂亮小分子蛋白條帶

時間:2021/9/17閱讀:1652
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做過 Western-Blot 的童鞋知道,分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍,我待小分子蛋白如初戀。抱怨是沒用的,想方設法解決問題才是正道。一次又一次的調整方案,一次又一次的徒勞無功。在此,總結了小分子蛋白之路經驗,供有需求的童鞋參考。


一、提蛋白的過程在 30 分鐘之內完成,提完蛋白立即加入上樣緩沖液煮沸(煮沸的時間長一點,一般 20 分鐘),準備好蛋白樣品后立即電泳。(小分子蛋白容易形成多聚體,這樣可以大大減少多聚體的形成)。


二、電泳時,電泳的時間要足夠長。習慣是先用 60-80V 電壓跑完濃縮膠,再以 100-120V 電壓跑分離膠,溴酚藍電泳至玻璃板底部。伯樂系列的電泳槽一般電泳 2 個小時左右,GE 以及百晶系列的電泳槽要電泳 4 到 5 個小時。電泳時要在冰水浴中進行。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的膠(若用 0.75mm 厚的膠時要適當縮短轉膜時間)。


三、轉膜時,盡量用濕轉法(半干轉也可以,但是容易轉過)。轉膜緩沖液中,甲醇濃度要達到 20%。PVDF 膜,財大氣粗的土豪可以用 0.22 微米的膜。對于我們大多數窮人來說,0.45 微米的膜也是可以的。以下是摸索出來的轉膜時間(濕轉法,0.45 微米的膜),供大家參考。


如何優雅地獲得漂亮小分子蛋白條帶


四、一抗孵育因為多數小分子蛋白的表達量較少,所以我一般孵育至少 48 個小時,甚至孵育 72 個小時。以上方法適用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa,則不用 SDS-PAGE 凝 膠電泳(蛋白與 SDS 共遷移,影響分離度,得不到很好的分離效果),應該采用 Tris-Tricine 緩沖系統與 Tricine 分離膠。具體操作步驟見《精編分子生物學實驗室指南》338-340 頁(這本書每個實驗室必會備,若沒有,可以在孔夫子舊書市場上買一本)。


需要注意的是,Tricine 電泳時,蛋白樣品用 Tricine 樣品緩沖液處理,加樣前在 37-40℃沙浴中處理一個小時(不要煮沸!不要煮沸!不要煮沸!重要的事情說三遍)。內槽中加滿陰極緩沖液,外槽中加滿陽極緩沖液(千萬不要加反了。否則蛋白全部進入緩沖液!)。 

最后,祝做小分子蛋白的童鞋實驗之路順利,早日做出滿意的結果。

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