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避免踩坑,注意別踩DNA測序里的大坑!

時間:2021/8/27閱讀:7815
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DNA 測序技術自從發明以來,作為一種重要的分子生物學手段,正在科研和臨床上得到了越來越廣泛的應用。下面,介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個前車之鑒吧。


坑一:信號衰減/中斷

測序信號衰減和中斷,是測序過程中的常見問題,原因多種多樣:模板中含有重復序列,模板中含有高級結構,模板中 GC 含量過高等,都會使得測序信號衰減和中斷。另外,引物的質量不好,試劑失活了,都會造成這種問題。解決的方法:反其道而行之,采用反向引物來進行測序,然后通過序列拼接獲得全長。有時候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里,教大家一個小竅門:在這個過程中,可以適量地加入 DMSO,并且進行擴增。


坑二:重疊峰/亂峰

這個問題一般是由于序列前面有連續的堿基,或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示,模板中有單一位點的堿基缺失,堿基缺失導致測序結果移碼。

避免踩坑,注意別踩DNA測序里的大坑!

現在有很多測序公司,號稱可以幫助設計引物;號稱引物是 PAGE 級別的。這里,嚴重不推薦哈。最好還是自己動手,豐衣足食。解決辦法:自己設計引物;自己合成引物;自己將引物進行 PAGE 純化。反正就是掌握一個原則:自己動手,豐衣足食。


坑三:Ploy 結構

有的時候,我們會遇到 Poly 結構,就是 G/C rich,G/C Cluster,Poly A,Poly T 結構等。這種結構的測序容易出現移碼現象,導致測序信號衰減和中斷(如下圖)。解決方法:還是反其道而行之。采用反向引物對模板進行測序,測到該 poly 結構處,進行拼接,不就可以獲得序列全長嘛。

避免踩坑,注意別踩DNA測序里的大坑!


坑四:空載體

原因為:目的片段插入失敗,或者培養過程中目的片段丟失。解決方案:重起爐灶。重新挑選單克隆,進行 PCR 后,再送去測序。


坑五:測序結果和文獻資料不一樣

這個會以為是實驗哪里出問題了,或者是測序公司那里出問題了。這個問題是沒有辦法滴。同一種動物,不同的種族,甚至不同的個體,基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產物克隆測序,那還有 PCR 過程中的錯配因素等等。

一般比較正規的測序公司,提供的測序結果都是忠實結果,和文獻序列不一樣,也就只好不一樣啦。


坑六:重復序列

如下圖所示,好看吧?好看是好看,但是真的看到這個結果,可能就要哭鼻子了。可能的原因:樣品中就含有重復序列,結果導致:測序結果和 Poly A/T 的結果一樣。這也會導致 Frame 滑動,結果出現移碼。

避免踩坑,注意別踩DNA測序里的大坑!


解決辦法: 還是反其道而行之,反向測序。有時能夠順利的通過重復序列區域,但是有時候又不一定能夠。全靠運氣吧。如果能夠的話,通過多次的測序結果比對,還是做拼圖游戲吧,拼接可以得到全序列結果。

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